毕业论文实验报告学生姓名：石书鹏学号：20080357 学院：生命科学与技术学院专业：08 生物工程 2 班论文题目：木瓜多糖的提取工艺研究指导教师：吴耀辉副教授评阅教师：王卫讲师2012 年4 月20 日本课题要研究或解决的问题和拟采用的研究手段（途径）本实验对木瓜中水溶性多糖的提取工艺进行了研究，多糖类化合物具有强亲水性，极易溶于水，和在亲水性比较强的乙醇中也难于溶解的性质，确定采用水提醇沉（水作为溶剂，乙醇来沉淀多糖）的方法提取多糖。

分析提取时间、提取温度、固液比、提取次数对多糖提取率的影响，确定其最佳工艺条件。

并且对多糖的抗氧活性进行探讨，为木瓜的综合利用提供依据。

1 材料与仪器1.1 原料新鲜木瓜1.2 试剂95 %乙醇，无水乙醇（分析纯），苯酚（分析纯），浓硫酸（分析纯），蒸馏水，葡萄糖（分析纯）等1.3 仪器电子天平，粉碎机，鼓风干燥机，布氏漏斗，高速离心机，旋转蒸发仪，恒温水浴锅，752C紫外分光光度计，滴管，移液管，漏斗，烧杯，滴定管，锥形瓶等。

2 实验方法2.1 粗多糖提取及纯化步骤2.1.1 木瓜处理新鲜木瓜，洗净后，在温度50 ℃下烘干，经粉碎机粉碎后过60 目筛，收集粉末。

2.1.2 浸提称取一定量的木瓜粉加入适量蒸馏水，在设定条件下恒温浸提，并不断搅拌。

2.1.3 过滤离心将提取液用滤纸进行抽滤，弃掉滤渣,得澄清浸提液。

浸提液用台式高速离心机进行离心 5 min ，转速3500 r/min 。

2.1.4 浓缩将离心后的浸提液放入旋转蒸发仪中浓缩到原体积的1/5 。

2.1.5 醇沉将浓缩后的提取液加入 4 倍体积的95 % 的乙醇溶液中，静置24 h 以上。

2.1.6 离心将用醇沉淀的多糖液离心，并用无水乙醇洗涤 2 次～ 3 次，再次离心（转速3500r/min ，时间 5 min ），收集沉淀物。

2.2 粗多糖的含量测定方法2.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制精确取称110 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品25 mg，置于250 ml 容量瓶中，制得浓度为0.10 mg/ml 的葡萄糖标准溶液，准确移取标准溶液0.00 ml、0.20 ml、0.40 ml、0.60 ml 、0.80 ml 、1.00 ml 、1.20 ml 、1.40 ml 、1.60 ml 、 1.80 ml 、2.00 ml 浓度为0.10 mg/ml 的葡萄糖溶液，分置于试管中，各加蒸馏水补足至每管 2.00 ml 。

在各管中加入 5.00ml 显色液，然后振荡混匀，置于沸水浴中加热30 -35min ，流水冷却，于波长490 nm 处测定吸光度值。

以吸光值 A 为纵坐标溶液浓度（mg/ml）为横坐标绘制标准曲线。

2.2.2 粗多糖含量的测定将纯化后的木瓜多糖粗品溶解，定容到100 ml 。

用移液管移取 1.00 ml 样液置于试管中，再用移液管加入显色液5ml，于沸水浴中加热30-35 min 后于波长为490 nm的分光光度计中测量吸光度。

根据标准曲线、回归方程计算粗多糖含量，再由含量求出木瓜竹叶中多糖的含量。

3 实验结果C×V×n木瓜多糖提取率=× 100%m式中： C —提取液中木瓜多糖的浓度（g/ml ）m —称取的木瓜质量（g）n —稀释倍数V —粗多糖（m1）1）计算公式为：3.1 葡萄糖标准曲线的绘制根据表 1 的数据， 以葡萄糖浓度为横坐标， 吸光度为纵坐标， 绘制葡萄糖标准曲线， 如图 1。

y = 11.172x - 0.0043R 2 = 0.99050.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08葡萄糖浓度 mg/ml图 1 葡萄糖标准曲线由图 1 可知，葡萄糖与吸光度呈良好的线性关系，其回归方程： y=11.172x-0.0043式（ 3）相关系数:R2=0.9905式中 x 为葡萄糖浓度， y 为吸光度。

3.2 不同单因素条件对木瓜多糖得率影响的研究本试验首先主要考察几种对水浸提法提取木瓜多糖得率影响比较大的因素 [44] ，包 括浸提温度、浸提时间、浸提时的液固比。

从而找出这些因素影响木瓜多糖得率的大小 和作用范围，为响应面实验的设计提供依据。

3.2.1 浸提时间对多糖提取率的影响以 1 g 木瓜粉末为基准，各加入 50ml 蒸馏水，在 80。

C 下提取，分别考察提取时9 8 7 6 5 4 3 20 0 0 0 0 0 0 0 A/度光吸0.09间 1.0 h ，2.0 h ，3.0 h ，4.0 h ，4.5h ，5.5h 对多糖提取率的影响，再用苯酚- 硫酸法测定其多糖的含量，最后分析结果。

见表2与图2：图2不同浸提时间对多糖提取率的影响由表2和图 2 可知：随着浸提时间的增加，多糖得率也增加，但当浸提时间达到 4.5 以后，多糖得率反而下降，故再增加提取时间对多糖得率增加不明显，说明多糖已经基本析出。

3.2.2 温度对多糖提取率的影响准确称取 5 份木瓜粉,每份 1 g ，各加入50 ml 蒸馏水，分别在温度50。

C、60。

C、70。

C 、80。

C 、90。

C、95。

C下提取 4.5h ，再用苯酚-硫酸法测定其多糖的含量，分析不同温度对多糖提取率的影响，结果见表3与图3:340 50 60 70 80 90 100浸提温度 ℃图 3 不同浸提温度对多糖提取率的影响由表 3和图 3可知：随着浸提温度的增加， 多糖得率也增加， 但当温度达到 80℃以后， 多糖被破坏，得率反而下降，故再增加浸提温度对多糖得率增加不明显，说明多糖已经 基本析出 .3.2.3 浸提比对多糖提取率的影响在温度为 80℃ ，提取时间为 4.5h 条件下 ，考察了浸提比 20：1，30:1 ，40:1 ，50：1 ，60：1 ml/mg 情况下多糖的得率，浸提比对多糖提取率的影响结果见表 4与图 4。

浸提比 ml/mg 20 ： 1 30:1 40:1 50:1 60:1 提取率5.266.416.586.446.08由表 4和图4可知：随着浸提比的增加，多糖得率也增加，但当浸提比达到 40:1 以后， 多糖被破坏，得率反而下降，故再增加浸提比对多糖得率增加不明显，说明多糖已经基本析出。

7 6 5%率取提图 4 不同浸提比对多糖得率的影响3.3 响应面试验3.3.1 响应面设计为了找到各个因素之间的相互影响, 我们在单因子试验的基础上进行响应面试验, 优化提取工艺。

选择浸提时间，浸提温度，浸提比 3 个对多糖提取影响较大的因素, 按表 6 设计三因素, 三水平实验，结果见表7 。

表 6 响应面分析因素与水平因素水平-101浸提时间/h 4.0 4.5 5.0浸提温度/ ℃708090浸提比/ ml/mg30：140:150:1利用Design Expert 软件进行多元回归拟合分析，得出多糖得率与浸提处理各因素变量的二次方程模型为：多糖得率=27.75+0.31A+0.10B+2.13C+0.17AB-0.96AC+0.22BC-2.63A 2-3.34B 2-4.47C 式中：A- 为浸提时间h ；B- 为浸提温度℃ ；C- 为浸提比ml/mg 对表7 数据进行方差分析。

方差分析及显著性见表8.表7 响应面分析方案及试验结果Std RunFactor 1A:浸提时间hFactor 2B:浸提温度℃Factor 3C：浸提比ml/mgResponse 1 多糖得率%11 4.070.0040.0021.8 92 4.570.0030.0018.381 73 4.080.0050.0023.47 134 4.080.0040.0024.2 35 4.090.0040.0021.5 176 4.580.0040.0027.81 107 4.590.0030.0018.281 168 4.580.0040.0027.8 49 5.090.0040.0021.8 610 5.080.0030.0020.3 1411 4.580.0040.0028.8 512 4.080.0030.0017.4 813 5.080.0050.0022.55 1214 4.590.0050.0022.2099 215 5.070.0040.0021.4 1516 4.580.0030.0019.4 1117 4.570.0030.0021.4099表8 方差分析及其显著性检验平方和自由度均方F值p值显著性方差来源模型172.29919.1421.370.0003significant A0.8510.850.940.3637B0.08010.0800.0860.7737C39.78139.7844.410.0003AB0.1210.120.140.7225AC 3.651 3.65 4.070.0834BC0.2010.200.230.6489A^228.04128.0431.310.0008B^246.43146.4351.830.0002C^280.90180.9090.32< 0.0001残差6.2770.90失拟差5.615 1.12 3.400.2428Not significant纯误差0.6620.33总和178.5616从表8中可以看出，本实验的模型极显著( p<0.01), 失拟相不显著，( p=0.2428) ，因而该模型拟合程度比较好，实验误差小，可以用此模型对提取木瓜多糖得率进行分析和预测。

3.3.2 响应面分析三个因素的相互作用_____ —艸B：没提温度75加、＜i2n尢浸提时何A) In 4 DU图5浸提时间与浸提温度交互作用对多糖得率影响的响应面立体分析图和相应等高线图图7 浸提比与浸提时间交互作用对多糖得率影响的响应面立体分析图和相应等高线图图5- 图7 是利用响应面工具Design Expert (version 8.0.6) 得到的多元回归方程绘制的应面立体分析图和相应等高线图，所拟合的响应曲面和等高线图能够比较直观地反应各因素和各因素间的交互作用和因素与响应值（木瓜多糖得率）之间的作用，图5-图7 表明，三个响应曲面均为开口向下的凸形曲面，同时等高线最小椭圆的中心在所选的-1~1 范围内，说明响应值（木瓜多糖得率）在所选择的三个因子设计的范围内存在极大值。

三个图中的图7 的等高线成椭圆形状，同时低编码值的A和高编码值的A时，响应值随着B的变化，变化趋势不同。

说明A（浸提时间）和C（浸提比）有一定的交互作用，这与方差分析的结果相吻合。

分析图5和图6，这种交互的关系不明显，说明A和B，B 和C 间交互效应不显著，比较几个图可以看出C（浸提比）对响应值木瓜多糖得率的影响比较大，响应值的变化也比较大。