辽宁农业职业技术学院毕业论文系别：生物技术系专业名称：兽药生产与营销论文题目：鸡胚成纤维细胞传代学生姓名：郐永琳指导教师：***评阅人：成绩：二O一O年六月二十日评阅人评语：评阅人签字：年月日目录摘要 (1)关键词 (1)前言 (1)1材料 (1)1.1仪器 (1)1.2种蛋 (1)1.3犊牛血清 (1)1.4溶液 (1)2方法 (2)2.1鸡胚的选择与孵化 (2)2.2鸡胚原代细胞制备 (2)2.3细胞传代 (4)3结果与分析 (4)4讨论 (4)4.1温度 (4)4.2P H (5)4.3气体 (5)4.4细胞接种量 (5)4.5无菌条件 (5)5结论 (5)参考文献 (6)致谢 (6)鸡胚成纤维细胞传代摘要：采用10日龄SPF鸡胚，进行消化，制备原代细胞，当细胞长成良好单层时，按1:2比例进行细胞传代，找出鸡胚细胞传代方法和情况。
其结果是：按本实验室方法进行鸡胚传代，传至20代以上细胞形态没有发成变化，细胞生长良好。
细胞数量大大增加。
为病毒的研究和疫苗生产提供条件。
关键词：鸡胚；传代；生长特性前言细胞培养的方法是将机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
细胞在培养瓶长成致密单成后，已基本饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须传代（再培养）。
也是将细胞保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种操作的必经过程，在这个过程中可以掌握其操作过程又能观察到细胞的生长情况。
1 材料1.1 仪器培养箱、培养瓶、玻璃漏斗、吸管、移液管、纱布、水浴锅、手术剪、镊子、培养皿、烧杯、瓶塞、培养盘、蛋托、超净工作台、显微镜、三角烧杯、95%酒精、75%酒精棉、碘酒棉、废液缸等。
1.2 种蛋SPF种蛋，由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供。
1.3 犊牛血清多用胎牛或犊牛血清。
由颈动脉无菌放血。
采血前先向瓶内加些等渗盐溶液湿润瓶避，采血后置室温或37℃温箱内待血液完全凝固后，有灭菌玻棒将血块自瓶壁分离。
随后再置室温或4℃冰箱内一天，即可吸取血清，如有少量红细胞可离心沉淀除去。
经滤过除菌分装，置-20℃冻存，使用前56℃水浴中灭活30min。
1.4 溶液1.4.1 Hank，s液NaCl16g、Na2HPO40.304g、KCl 0.8g、KH2PO40.12g、MgSO40.4g、C6H12O60.28g、酚红2mL、水解乳蛋白10g、加蒸馏水至2000mL高压灭菌116℃30min。
2g、CaCl21.4.2 酚红苯酚红1g、NaOH0.12g加蒸馏水至200mL。
1.4.3 7.5%NaHCO3溶液NaHCO36g、加蒸馏水至80mL高压灭菌116℃30min。
1.4.4 EDTA胰蛋白分散液（滤过）NaCl8g、NaHCO30.5g、KCl0.4g、胰蛋白酶0.5g、C 6H12O61g、EDTA0.2g、1%酚红0.2mL加蒸馏水至1000mL。
1.4.5 消化鸡胚用胰酶液（滤过）NaCl 8g、KH2PO4 0.06g、KCl0.4g、胰酶2.5g、C6H12O61g、1%酚红2mL、Na2HCO30.152g加水至1000mL。
1.4.6 双抗（滤过）青霉素200万单位、链霉素200万单位加蒸馏水至200mL。
1.4.7 MEM液（滤过）MEM9.606g、NaHCO32.2g加蒸馏水至1000mL。
2 方法2.1 鸡胚的选择与孵化应选健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋。
受精蛋最好不含有母源抗体，特别是针对培养病毒的抗体，为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好；蛋壳要干净，孵化前最好不洗。
卵必须新鲜用孵卵箱孵化，一般不宜保存过长时间，通常保存期不应超过10天，即5天以内最好，而且不宜在高温下保存，通常保存于4～20℃，以10℃条件下最好。
要特别注意温度、湿度和翻蛋。
孵化条件一般选择相对湿度为60%，最低湿度36%，一般37.5～39℃。
每日翻蛋最少3次，并注意空气流通，大头向上，注意鸡胚位置。
孵化3～4天，可用照蛋器在暗室观察，鸡胚发育正常时，可见清晰的血管及活的鸡胚，血管及其主要分支均明显，呈鲜红色，鸡胚一直在活动。
未受精和死胚胚体固定在一端不动，看不到血管或血管消散，应剔除。
2.2 鸡胚原代细胞制备2．2．1 营养液的配制在Hank，s液中加入青霉素、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素100IU/mL，再用7.5%NaHCO3调整PH至7.2～7.4；置4℃冰箱保存，将胰蛋白酶PH值调整为7.6，分装于小瓶中，置-20℃冰箱保存。
操作前将Hank，s液和胰蛋白液置37℃水浴锅中预热备用（注意，胰蛋白酶溶液不宜反复冻融）。
2.2.2 取胚及剪碎取10日龄鸡胚，在超净工作台内，将胚蛋气室端向上放置，在气室部用5%碘酊消毒后，75%酒精棉脱碘，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜、绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。
减去头部、翅、爪及内脏，用PBS或Hank，s液洗去体表血液，移入灭菌三角烧瓶中，用灭菌剪刀剪碎剩余鸡胚组织，使之成为1～2mm大小的碎块,加PBS或Hank，s液轻摇，静置1～2min，使之组织块下沉。
吸去上层悬液，依同法再洗2次，至上悬液不混浊为止，吸完Hank，s液，组织碎片置三角瓶底。
2.2.3 消化置水浴锅内取出预热的胰酶，按组织块量5～6倍加入烧杯中（每个胚5～挥发及污染。
37℃水浴10～30min，由于胰酶作用，使10mL），三角瓶上加塞，以免CO2细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，此时再轻摇三角瓶，可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时，则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。
消化完全后，加入培养液以终止胰酶消化作用。
2.2.4 细胞分散取出三角瓶后静置2min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用Hank，s液反复清洗3次，以洗去胰酶，尽量吸完上清液，留下组织块。
加2mL含血清的MEM培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞冲散，此时可使营养液混浊即为细胞悬液，静置1min，使未冲散的组织块下沉后，上层细胞悬液通过带6～8层纱布的漏斗过滤一次；进行细胞计数，静置培养时将细胞悬液调成含100万～250万个细胞/mL。
2.2.5 细胞分装培养将集细胞瓶中的细胞摇匀，再加入适量的营养液，使每毫升含细胞50万～60万个左右，按细胞液总量10%加入犊牛血清、双抗100IU/mL，调节PH值为7.0～7.2，用正压方法将细胞分装到细胞培养瓶中，每瓶1000mL（细胞瓶容量1%）。
分装完毕，在火焰控制下，除去分液管道，将细胞培养瓶塞上各管管口换上一头塞有棉花的胶头开口折扎好，在瓶颈以上用40cm×40cm的牛皮纸将瓶口及胶塞包扎好送温室转瓶培养；细胞培养液的营养成分含量相对来说是固定的，它只能支持一定数量细胞生长与分裂，原代细胞培养细胞的数量不宜太多，否则细胞分裂后，营养液中的氨基酸含量因消耗而下降、营养液的营养水平难以维持，反过来还会限制细胞的生长。
2.2.6 细胞观察单层细胞培养，由于细胞具有停泊依赖性，细胞必须贴附在瓶壁上才能生长，让它悬浮在液体介质中（如悬浮在营养液或维持液中），细胞很快就会死亡。
原始的单层细胞培养液的工艺方法比较简便，只要培养容器和培养液能满足分裂繁殖需要，密封性好，完全可以达到培养的目的。
（1）细胞瓶置转瓶架上，要随时查看转动情况；在48h内严禁搬动，72～96h要逐瓶检查细胞生长情况，并记录生长情况和细胞密度。
培养细胞一般于24h左右开始分裂；（2）出使时细胞分裂形成若干个细胞岛，以后再连成片，培养24～96h后大都能形成致密单层；（3）判别细胞生长情况常以贴壁好坏作为标准，用下列符号对细胞生长情况进行评估；（-）：表示细胞不贴壁或贴壁不分裂；（+）：细胞贴壁伸展或形成孤立细胞岛，其覆盖面积占瓶壁的25%左右；（++）：细胞分裂成较大的岛状，覆盖面积占瓶壁50%或50%以上；（+++）：细胞覆盖面积达瓶壁75%以上，透明度好，立体感强；（++++）：细胞满瓶覆盖，形成致密单层，透明度好，立体感强，形态丰满。
2.3 细胞传代选取生长良好、以形成致密单层（++++）的细胞培养瓶；在无菌室中，于每瓶细胞中加入100mL左右的分散液（EDTA）。
加液后，轻而快地转动细胞瓶，使EDTA与瓶壁细胞充分接触，并随时注意观察瓶壁上细胞层的变化情况。
待瓶壁上细胞层开始出现轻微的龟裂（像干旱水田的干裂缝隙样）时，立即倒去EDTA，加入营养液（含牛血清10%，双抗0.5%PH6.8～7.0的乳汉液）充分摇动，使营养液沿瓶壁转动冲刷壁上细胞，直至细胞完全脱落为止。
然后按所需要量加入营养液，摇匀后分装。
分装率为1:2如为传代细胞系，其分装率可提高到1:3甚至1:4。
做好标记放37℃培养箱中培养。
3 结果与分析共消化7批细胞，01批细胞和06批细胞分别与消化后48小时、02批细胞传至第3代时，细胞形态发生变化，产生细胞病变，培养液发生混浊，确定为细菌污染。
03批细胞和04批细胞传至第5代时，细胞形态发生变化，产生细胞病变，但是培养液没有发生混浊，可能是病毒污染所致。
05批细胞传至第11代时，细胞形态发生变化，产生细胞病变，培养液发生混浊，确定为细菌污染。
07批细胞传至20代时，细胞能够与48～72小时长成良好单层，从21代后细胞生长开始缓慢，传至24代时7天后也没有长成单层。
出现这种情况的原因有待进一步研究。
见表1。
表1 各批次细胞传代情况批次 01批 02批 03批 04批 05批 06批 07批代次 0 2 4 4 10 0 204 讨论影响细胞生长的因素很多，除了生长液和维持液因素外，还有以下主要因素。
4.1 温度细胞培养的最适温度与细胞来源的动物体温相似，一般为37～38℃,高温易导致细胞死亡，低于可减慢或终止细胞的增殖。
4.2 PH细胞培养最适PH一般为7.0～7.4，因细胞种类不同而稍有差异，通常以不低于6.8和超过7.6为宜，当低于6.8和超过7.6时，对细胞生长会有抑制作用。
4.3 气体细胞生长需要O2和CO2。
再用橡皮塞密封的培养瓶内，由于生长液中的-HCO3及细胞生长时分解糖而排出CO2。
可供细胞代谢的需要。
如用CO2培养箱培养，则更有利于细胞生长，培养瓶不需要密封。
4.4 细胞接种量细胞浓度与形成细胞单层的速度成正比。
当细胞贴壁以后，细胞代谢过程中产生刺激细胞分裂物质，这种物质需要达到一定浓度时才能促进细胞的分裂繁殖，细胞量过少，排出的刺激细胞分裂的物质少，作用小，而细胞不易形成单层，容易死亡，但接种量过大，形成单层后很快脱落，致使死细胞和细胞碎片对分裂细胞发生毒性作用，导致细胞生长受到抑制，甚至死亡。