广东药学院基因工程（跨课程）综合性实验论文姓名班级学号指导教师广东药学院生命科学与生物制药学院生物制药研究所目录摘要 (2)前言 (3)一、材料与方法 (3)1.1 材料 (3)1.1.1 重组蛋白质药物单元的实验材料 (3)1.1.2重组DNA药物单元的实验材料 (3)1.2 方法 (4)1.2.1 重组蛋白质药物单元 (4)1.2.1.1 工程菌构建（已由老师完成） (4)1.2.1.2 工程菌表达筛选 (6)1.2.1.3 制备IL-18工程菌甘油种 (8)1.2.1.4 GST工程菌生长曲线分析 (8)1.2.1.5 GST工程菌表达影响因素试验 (8)1.2.1.6 表达进程分析 (9)1.2.1.7 凝胶扫描分析 (9)1.2.1.8 发酵工艺（观摩） (9)1.2.2 重组DNA药物单元 (9)1.2.2.1 质粒TCRVα12.2-Vβ7.1-EYFP的大规模制备 (9)1.2.2.2 TCR质粒-脂质体复合物制备与分析 (10)1.2.2.3 TCR体外转染活性检测 (11)1.2.2.4 TCR转染体内试验 (12)二、结果与讨论 (12)2.1 重组蛋白质单元结果与讨论 (12)2.1.1 IL-18工程菌表达筛选SDS-PAGE (12)2.1.2 GST工程菌生长曲线分析 (14)2.1.3表达影响因素试验 (15)2.1.4 表达进程试验 (16)2.2 重组DNA药物单元结果与讨论 (18)2.2.1质粒阴离子交换层析纯化 (18)2.2.2 质粒柱层析样品琼脂糖电泳分析 (19)2.2.3 质粒-脂质体复合物制备 (20)2.2.4 TCR转染基因表达荧光检测 (20)2.2.5 TCR体外转染活性检测 (21)2.2.6 TCR转染体内试验 (23)三、小结 (25)致谢 (25)摘要：本综合性实验分为“重组蛋白质类药物”和“重组DNA类药物”二个单元。
重组蛋白质药物以hIL-18的大肠杆菌表达系统为例，全面介绍工程菌构建、表达筛选、甘油种制备、生长与表达分析、发酵工艺单元操作和表达产物分离纯化等基因工程药物研发与生产实践中最常用的技术与工艺过程。
“重组DNA药物”单元以质粒TCRVα12.2-Vβ7.1-EYFP为例，介绍质粒DNA大规模制备、阳离子脂质体与质粒DNA复合物制备、T细胞体外转染、转染T细胞目的基因表达和体外活性检测、体内给药试验等。
关键词重组蛋白药物; hIL-18 ; 重组DNA药物 ; 阳离子脂质体与质粒DNA复合物Abtract：The comprehensive experiments are divided into two units ,which is " Recombinant Protein Drugs" and "Recombinant DNA Drugs". The unit ,Recombinant protein drugs ,takes example for hIL-18 in E. coli expression system.It comprehensively introducted the most usual technology and process of R & D and production practice of the genetic engineering drugs , such as the construction of engineering bacteria, expression screening, glycerol kind of preparation, growth and Expression Analysis, fermentation process unit operation and the purification of expression product.The unit of "Recombinant DNA drug" taked plasmid TCRVα12.2-Vβ7.1-EYFP as example.It introducted the large-scale preparation of plasmid DNA, Preparation of cationic liposomes- plasmid DNA complex, in vitro Transfection of T cells, expression and in vitro activity assaying of the target gene of transfected T cells and undertaking the test in vivo.Key words Recombinant Protein drugs ; hIL-18 ; Recombinant DNA drugs ; cationic liposomes-plasmid DNA complex前言生命科学与生物技术的最主要任务之一是利用其理论与技术研究成果为人类的健康服务，生物技术制药则是其最主要的应用领域，且在重大传染性疾病、恶性肿瘤及其它疑难杂症防治方面具有巨大的潜力。
药品的研究开发是一项庞大的系统工程，实验室研究发现的任何候选药物要开发成新药都需要经过生产工艺和质量控制研究、有效性评价和安全性评价等过程。
需要特别指出的是，生产工艺和质量控制研究的内容和任务还会始终贯穿于产品投产上市的过程中，相应的技术手段也是作为企业生产或质量控制人员必备的技能。
因此，作为生命科学与生物制药学院的本科生，了解生物技术药物研究、开发和生产的过程、掌握与生产工艺和质量控制研究密切相关的技术手段是非常必要的。
以蛋白质为基础的基因工程药物和基因工程抗体是当今最主要的生物技术药物形式，以DNA为基础的基因治疗制剂和DNA疫苗是未来生物制药的主要发展方向之一。
一、材料与方法1.1 材料1.1.1 重组蛋白质药物单元的实验材料1.1.1.1 仪器超净工作台、移液枪（量程：10—100，0—1000）、灭菌枪头、标记笔、无菌牙签、带塞试管、恒温摇床、恒温培养箱、带塞三角瓶（500mL）、EP管(1.5mL)、可见分光光度计、电泳仪、垂直电泳装置、水浴锅、离心机、台式高速离心机、培养皿、冰箱（-20℃，-80℃，4℃）、烧杯、凝胶成像系统1.1.1.2 试剂氨苄青霉素、LB培养基、pBV220—hIL-18转化平板、GST工程菌平板、2×上样缓冲液、10×电泳缓冲液、10%APS、30%胶母液、10%SDS、TEMED、分离胶缓冲液（pH8.8）、浓缩胶缓冲液（pH6.8）、考马斯亮蓝染色液、脱色液、10%甘油、去离子水、IPTG1.1.2重组DNA药物单元的实验材料1.1.2.1 仪器高速冷冻离心机、台式高速离心机、离心机、离心杯、离心管、水浴锅、4℃冰箱、超净工作台、移液枪、灭菌枪头、500mL 三角瓶、常压层析系统、烧杯、水平电泳装置、电泳仪、紫外检测仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、1.5mLEP 管、恒温培养箱、灭菌玻璃滴管、12孔培养板、细胞计数板、电子显微镜、培养瓶、荧光显微镜、一次性1mL 注射器、冰盒1.1.2.2 试剂STE 、碱裂解溶液Ⅰ（（高压灭菌）：50mmol/L 葡萄糖、 25mmol/L Tris －Cl （pH8.0））、碱裂解溶液Ⅱ（0.2M NaOH 、 1％（m/V ）SDS （高压灭菌））、碱裂解溶液Ⅲ（5 mol/L 乙酸钾、冰乙酸、H 2O ）、异丙醇、70%乙醇、TE 、0.02MNaCl 的TE 溶液、0.3M NaCl的TE 溶液、1.0M NaCl 的TE 溶液、0.5M NaOH 、RNA 酶、双蒸水、生理盐水、1.0MnaCl 、20%乙醇、琼脂糖、TAE 、EB 、电泳缓冲液、Marker 、Buffer 、质粒TCRV α12.2-V β7.1-EYFP 、脂质体、肿瘤细胞BEL-7402、胰酶、完全培养基、4%苯酚溶液、1640培养基、胎牛血清、IL-2、双抗（青霉素、链霉素）1.2 方法1.2.1 重组蛋白质药物单元1.2.1.1 工程菌构建（已由老师完成）（1）pBV220-hIL-18表达载体和工程菌构建在本综合性实验中目的基因的表达载体为pBV220，该载体的物理图谱见图1。
该载体有一个氨苄青霉素抗性基因，在多克隆位点的上游为λ噬菌体的P L 和P R 启动子，P L 和P R 启动子受λ噬菌体CI 基因的负调控。
CI 阻遏蛋白是温度敏感蛋白，在28-37℃培养时，CI 产生抑制作用，在温度升至42℃时，CI 被破坏，这样就解除了对启动子的封闭，使P L 和P R 启动子开始下游基因转录。
目的基因为hIL-18的编码序列（cDNA ），采用RT-PCR 技术从外周血细胞中获得。
首先据Genebank 报道序列设计引物，并在引物的5’端引入EcoR I 位点和启始密码子ATG ，在3’端引入Hind Ⅲ位点。
IL-18基因的RT-PCR 扩增产物经EcoR I 和Hind Ⅲ双酶切插入表达载体pBV220的相同位点即得hIL-18的表达载体pBV220-hIL-18。
构建的表达载体pBV220-hIL-18按常规方法转化大肠杆菌DH5α株后即得“重组hIL-18”的工程菌。
图 1 pBV220物理图谱（2）pGEX-GST表达载体和工程菌构建pGEX-GST为商品化融合表达载体，主要用于外源基因的可溶性融合表达。
GST （谷胱甘肽转移酶）为大肠杆菌宿主细胞的天然高效、可溶性表达的蛋白。
以其作为融合表达“标签”有二点优势：a) GST可以促进二硫键的形成，使目的基因融合表达产物能正确折叠，因而常以可溶的表达产物存在；b)GST属于大肠杆菌高效表达的天然产物，其mRNA的5‘端具有最适的结构，有利于融合基因mRNA的翻译，因此可大大提高融合基因表达水平。
在pGEX-GST中，GST处于复合启动子Tac的控制之下，因此可采用IPTG诱导。
其载体如图2所示，图中所示载体中还有一个特殊设计，即GST与目的蛋白的融合位点位PreScission蛋白酶识别位点，融合蛋白可在4℃下进行酶切反应，可避免其它蛋白酶类37℃那样的高温条件对目的产物的破坏。
本综合实验中采取的是无外源基因的载体，即只表达GST，主要用于给同学们展示与pVB220-hIL-18不同的另一种启动子和表达诱导方式（PL/PR vs Tac；温控vs IPTG诱导），并便于“表达进程分析”。