理5min, 90℃处理2min,多酚氧化酶活性基本丧失。 考虑到马铃薯淀粉加热可能变性的特点,在加工中 不宜采用热处理的方法防止褐变。

马铃薯中多酚氧化酶的最适pH为6.6,在pH6-7
之间酶的活力较高,在加工中应尽量避开此pH
范围,可采用pH4.5左右来加工。

二巯基丙醇,亚硫酸钠,半胱氨酸,抗坏血酸对

4.马铃薯

马铃薯块茎中多酚氧化酶的活力和多酚的分布是 不均匀的。在块茎外部，酶的活力最高，而在脐、 芽眼和皮中，酚类化合物浓度最高。 贮藏期间，在马铃薯块茎的外部，多酚氧化酶活 力和多酚的含量增加，而在内部多酚氧化酶活力 减少 马铃薯中酪氨酸的含量是决定褐变速率的主要因 素。



马铃薯中多酚氧化酶的最适温度为30℃,在80℃处

常用的酸有：柠檬酸、苹果酸、磷酸、抗坏血 酸、混合酸。

柠檬酸可降低pH，还可络合酚酶辅基Cu2+，但单
独用效果不大。常与抗坏血酸、亚硫酸合用。

实践证明：0.5%柠檬酸 + 0.3%抗坏血酸效果好。
抗坏血酸不但能降低体系pH，而且具有还原剂
的作用，可将体系中的醌类及其衍生物还原成
酚，并通过自身氧化来减少体系的含氧量。
即：多酚类物质、多酚氧化酶、氧气
除去多酚类物质困难，不现实。 ∴一般为 降低多酚氧化酶活性、驱氧

(1)加热钝化酶活性



75～95℃、5～7S的加热处理，可使大部分酶 活性丧失。 常用的方法有：漂烫、巴氏杀菌 加工中，必须严格控制时间和温度。 加热温度过高，加热时间过长，可抑制酶褐变， 但会影响食品品质；加热不足，不能抑制酶褐 变。 微波加热，热穿透力强，迅速均匀，不影响风 味。
酶促褐变:较浅色的水果、蔬菜在受到机械性 损伤（削皮、切片、压伤、虫咬、磨浆、捣碎） 及处于异常环境变化（受冻、受热等），在酶 促催化下氧化而呈褐色，称为酶促褐变。
西瓜、香瓜、桔子、柠檬 无酚酶，不褐变。

实例1：土豆的褐变
实例2：含有儿茶酚水果的褐变
褐变防止方法 酶促褐变的三个条件，缺一不可。
多酚氧化酶活性具有强烈的抑制作用,能有效
地防止褐变引起的质量问题。
思考题

简述酶促褐变的机理及其控制措施。

控制果蔬加工和贮藏过程中酶促褐变。

多酚氧化酶在植物中的含量随品种不同而有很大 变化，在众多的水果和蔬菜中，橄榄中的多酚氧 化酶活力最高。

多酚氧化酶的活力分布还取决于果蔬的成熟度。 在植物叶片中，很大一部分酶活力集中在叶绿体 中，在马铃薯块茎中，几乎集中在亚细胞部分中； 在新采收的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在于 叶绿体和线粒体中。
1.催化反应
多酚氧化酶可以催化两种不同类型的反应： （1）一元酚羟基化，生产相应的邻二羟基化合物

（2）邻二酚氧化，生成邻醌类物质。
反应机制：氧首先与酶结合，然后邻二酚与酶结合，接 着氢从酚转移到Cu2+形成氢过氧化络合物，此结合物 再同第二个邻二酚结合，反应中没有自由基中间物形 成。

两种反应都需要有分子氧的参与。

五、多酚氧化酶的分子形式

多酚氧化酶有多种分子形式
原因：①类似的亚基不同程度的聚合；②不 同亚基不同方式的结合;③酶蛋白质构象的改 变;④前三种情况的结合。
多酚氧化酶多种分子形式之间的差别表现在 底物特异性、最适pH、温度稳定性、对抑制 剂敏感性、氧化和羟基化活力的差别。

六、多酚氧化酶活力测定

多酚氧化酶的提取方法：

丙酮粉法 匀浆法 匀浆浸提法




多酚氧化酶的测定方法：
（1）检压法：在一定温度、pH和基质浓度下， 多酚氧化酶氧化基质的速度与单位时间内的耗 氧量成正比。用瓦氏呼吸计测定耗氧率。

（2）氧电极法：利用氧电极测定反应中的耗 氧量来表示酶活力

（3）分光光度法：多酚氧化酶催化邻苯二酚 氧化成有色产物，单位时间内有色产物在 460nm处的吸光度与酶活强弱成正比。
（4）碘量滴定法 分光光度法操作简单，结果准确，最为常用。


七、水果和蔬菜中的多酚氧化酶及其底物

正常条件下，在未受损水果中，酚类物质是与多 酚氧化酶存在于不同部位。这种分布是通过一系 列膜系统实现的，受膜屏障的作用，这种区域性 的分布阻止了底物和酶的相互接触，所以正常组 织是不发生褐变的，一旦膜系统受损，使物质的 区域化分布破坏，多酚氧化酶与酚类物质接近并 与其发生化学作用，这将导致褐变。

单酚氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)
双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse, EC.1.10.3.2) 漆酶(对苯二酚氧化酶 laccase,EC.1.10.3.1)。


现在所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化 酶和漆酶的统称。 在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要 分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主 要包括漆酶和酪氨酸酶。
第八章
多酚氧化酶
一、多酚氧化酶的名称和自然界的分布
1、多酚氧化酶的名称

多酚氧化酶(1,2-苯二酚:氧 氧化还原 酶,EC 1.10.3.1) 一类含铜的氧化还原酶，催化邻-苯二酚 氧化成邻-苯二醌，也能作用于单酚单加 氧酶的底物。

多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚 或多酚形成对应的醌。 在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：

果蔬中不同的部位的多酚氧化酶含量差别很大， 例如葡萄皮中的酶活力比果肉中高。

茶叶中的多酚氧化酶分为游离态和结合态，前者 主要存在于细胞液中，属可溶态多酚氧化酶；后 者主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这 些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态。
二、多酚氧化酶催化反应及其作用底物


1.苹果中多酚氧化酶

多酚氧化酶是引起苹果褐变的重要原因之一 在苹果生长过程中，总酚含量逐渐下降，至成熟 期稳定，酶活力变化趋势与总酚类似。未成熟的 苹果比成熟的更易褐变 在大多数情况下，酶促褐变倾向在保藏期间是增 加的。 机械损伤可引起酶促褐变，但褐变的速率起初较 高，随后下降到零。


2.梨中的多酚氧化酶
2.温度对多酚氧化酶活力影响

不同种类、品种、部位的多酚氧化酶有不同的热 稳定性，通常最适温度在常温
加热易使酶失活 同一来源的多酚氧化酶的不同分子形式具有不同 的热稳定性


低温下多酚氧化酶的活力也有明显的下降，但活 性下降比较缓慢
四、多酚氧化酶的激活剂、抑制剂和果蔬酶 促褐变的防止

1.激活剂

多酚氧化酶活性的抑制方式： 化学抑制：硫脲、EDTA、巯基乙醇、亚硫酸钠、 柠檬酸、抗坏血酸、4-羟基苯甲酸酯等。 物理控制：改变贮藏环境的气体成分、热处理、 高压灭菌、辐射、超声处理等。 分子生物学方法：利用转基因技术阻碍多酚氧 化酶的表达、使用反义RNA技术降低多酚氧化 酶活性等。



植物中存在的多酚氧化酶在天然状态下一般以非 活性形式存在。可以通过高盐处理、机械损伤、 酸碱刺激或在尿素、表面活性剂、蛋白酶以及胰 酶的作用下活化。
激活机制主要包括：增溶作用、同工酶的互变和 分子修饰作用，以及酶-抑制剂复合物的分离和 蛋白酶的水解等使酶构象发生变化。

2.抑制剂和果蔬酶促褐变的防止
最适pH因酶的来源和底物的不同存在较大的差异。
多酚氧化酶的最适pH
(1)最适pH：4～7 (2)不同种类，不同品种的果蔬甚至果蔬的不同部 位得到的多酚氧化酶的最适pH也存在差异 (3)酶的提取或分离的方法对它的最适pH也有影响 (4)测定酶活力时所采用的底物和缓冲液对酶的最 适pH也有影响 (5大多数多酚氧化酶只有一个最适pH,在一些情况 下, 有第二个最适pH
(2)螯合酶促作用的金属离子

多酚氧化酶是以铜作为辅基的金属蛋白。
金属（铁、锡、铝等）离子是多酚氧化酶的激 活剂。 柠檬酸对Cu2+有螯合作用。 EDTA是一种金属离子螯合剂，可阻止金属离子 对褐变反应的促进作用，但其与作用对象有关， 有的效果则不明显。

(3)酸处理法

多数酚酶最适pH＝6～7，pH < 3失活(高酸性 环境会使酶蛋白上的铜离子解离下来，导致多 酚氧化酶逐渐失活，酶活性趋于最低。)
2.作用底物

水果、蔬菜中底物为： 一元酚类 邻二酚类（对位二酚也可） （间位二酚不作底物） 如： 水果中的儿茶酚
OH OH
土豆中的酪氨酸 HO CH2CHCOOH
NH2

重要的天然底物
影响多酚氧化酶作用的因素

一元酚和二元酚取代基的位置 较高的底物专一性 底物的相对专一性因来源不同而变化

多酚氧化酶在桃,苹果,香蕉,荔枝,马铃薯,莲藕和 莴苣中的含量也是相当高,然而它对这些果实起着 不好的作用,易引起褐变,造成变质和腐烂,对于果 蔬贮存及加工过程中的品质有重要影响。

热带水果50%以上的损失都是由于酶促褐 变引起的.同时酶促褐变也是造成新鲜蔬 菜例如莴苣和果汁的颜色变化,营养和口 感变劣的主要原因
多酚氧化酶蛋白包含两部分：


催化氧化与羟基化
羟基化活力容易损失（与小分子辅助因子
有关）

酶活力对来源不同的酶有很大差异
酶促褐变
多酚氧化酶催化的氧化反应的最初产物邻位醌将继 续变化。
①相互作用生成高分子量聚合物。
②与氨基酸或蛋白质作用生成高分子复合物。 ③氧化那些氧化还原电位较低的化合物。 其中①②导致黑色素的生成，反应③的产物是无 色的。

梨多酚氧化酶仅作用于邻苯酚,对于对苯酚、 间苯酚和一元酚无作用 以儿茶酚为底物,该酶的最适pH为6.5,在30℃ 活性最强.