乳腺癌反义寡核苷酸治疗的研究进展发表时间：2010-11-02T16:32:08.000Z 来源：《中外健康文摘》2010年第29期供稿作者：贾谊君[导读] 现针对进入临床前试验的反义寡核苷酸治疗乳腺癌所选择的靶点作一综述。

贾谊君（青岛大学医学院山东青岛 266071）【中图分类号】R737.9 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2010)29-0370-02【关键词】乳腺癌反义寡核苷酸基因综述文献反义寡核苷酸技术(ASODN)作为一种新的分子生物学工具及新型药物受到医疗界越来越多的关注。

许多反义药物作为抗肿瘤药物已进入临床试验，并取得了令人欣喜的效果。

1 反义寡核苷酸的作用机理简介1.1反义寡核苷酸是在体外人工合成的能与体内某RNA或DNA序列互补结合的短序列单链DNA。

它可以作为反义药物与细胞内特异的靶序列互补,从而抑制基因表达。

该技术的作用原理主要通过下列途径发挥作用：（1）ASODN与DNA结合，抑制DNA复制和转录，它通过在DNA结合蛋白的识别点处与DNA双螺旋结合形成三螺旋，阻止基因的转录和复制。

(2) ASODN可影响真核生物mRNA核内加工的步骤，如5’端加帽结构、3’端加polyA及剪接的过程，从而抑制了mRNA的成熟过程。

(3)ASODN与目标mRNA特异性碱基互补结合，阻断RNA加工、成熟，阻止核糖体与起始因子的结合，影响核糖体沿mRNA移动，从而阻止翻译。

1.2天然的ASODN能够很快被在细胞内存有的大量的核酸外切酶和核酸内切酶降解。

因此，ASODN必须要经过修饰才能在体内发挥作用。

研究表明，硫代修饰之后的ASODN稳定，具有良好的水溶性，并容易大批量人工合成来应用于临床的研究。

所以，目前硫代磷酸型的ASODN已应用于各个水平的研究领域中。

1.3反义寡核苷酸在乳腺癌的治疗研究中的应用主要通过抑制乳腺癌细胞生长、增殖、分化诱导凋亡，抑制乳腺癌细胞的转移和侵袭，降低乳腺癌的多药耐药性来实现。

1.4反义基因技术具有明显的优点，由于DNA序列在一般情况下是单拷贝，而mRNA是多拷贝，因此ASODN相比于反义RNA只需少量的ODN与DNA靶序列结合，就可以具有很强的抑制效果。

它治疗乳腺癌特异性高，副作用少，与化疗、放疗和靶向药物结合有协同作用，并已逐步从实验室走向临床。

2 针对主要的进入临床前试验的致乳腺癌基因的反义寡核苷酸的研究理论上认为任何致乳腺癌基因都可以成为ASODN的作用靶点，目前主要以细胞凋亡抑制基因、乳腺癌转移和血管生成基因、生长因子及受体、信号传导通路等作为常用的分子靶点。

目前已有蛋白激酶C，Bcl-2，Ras/Raf激酶，PKA，P53/MDM2,聚集素(clusterin),DNA甲基转移酶，核苷酸还原酶进入临床试验。

现针对进入临床前试验的反义寡核苷酸治疗乳腺癌所选择的靶点作一综述。

2.1 SurvivinSurvivin是一种凋亡抑制基因，定位于17q25上，在正常分化成熟组织（胸腺、胎盘、子宫内膜除外）中未见表达。

在人类癌症中Survivin过度表达，并且与化疗放疗耐受及较差的预后有关。

另外，在ErbB2过度表达的乳腺癌细胞株中往往有高表达的Survivin。

Lu J等用反义寡核苷酸抑制Survivin表达可以减慢ErbB-2过度表达细胞的有丝分裂速度，并且能够使其对促肿瘤细胞凋亡药物增加。

Yao H等发现联合应用AdKDR-CDglyTK及Survivin反义寡核苷酸对乳腺癌肿瘤细胞及血管内皮细胞有显著杀伤效果。

张静[1]等利用ASODN 封闭Survivin基因的表达，发现ASODN可明显抑制Survivin基因在乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中的转录及翻译，明显提高乳腺癌对多西他赛的敏感性。

扈煜[2]等采用脂质体介导SurvivinASODN转染乳腺癌细胞系MCF-7发现Survivin ASODN可有效下调MCF-7的Survivin mRNA及蛋白表达水平，并增强其对长春瑞滨的敏感性。

韩芳等发现Survivin ASODN还可增强MCF-7对紫杉醇药物的敏感性。

2.2 VEGF-A/VEGF-C血管内皮生长因子（VEGF）是一种促血管形成因子，在体外能够诱导血管内皮细胞的增殖和迁移，在体内能够促进血管新生。

VEGF-A可能是最强的促血管生成因子，同时VEGF-C是VEGF家族中最强的促淋巴管生成因子。

肿瘤的生长和转移与肿瘤脉管生成密切相关。

因此VEGF-A/VEGF-C可以成为治疗乳腺癌的新靶点。

Chen JS等人进行针对VEGF-C反义寡核苷酸的动物体内试验。

先将VEGF-C ASODN注入乳腺癌裸鼠原位移植瘤的模型中，检测肿瘤组织VEGF-A/VEGF-C mRNA表达和蛋白表达，并计算肿瘤微血管密度（MVD）和微淋巴管密度（LMVD）。

结果发现，反义组较对照组成瘤时间长，移植瘤生长速度慢，肿瘤重量小，VEGF-A和VEGF-C mRNA及蛋白表达弱，且MVD及LMVD低。

曲明阳等将VEGF-C ASODN以脂质体介导转染，检测VEGF-C mRNA表达水平，乳腺癌细胞与细胞外基质黏附及侵袭人工基底膜能力和乳腺癌细胞中MMP-2蛋白表达水平，结果显示，VEGF-C ASODN可能通过下调MMP-2表达来抑制乳腺癌细胞体外试验中的黏附和侵袭能力。

Zhao XH等探究了 G4PAMAM/VEGFASODN复合物对MDA-MB-231乳腺癌细胞中的VEGF和VEGF mRNA表达的影响和对血管内皮细胞生长的抑制作用。

结果显示，G4PAMAM/VEGFASODN在PH5-10的环境中表现出良好的稳定性，且与对照组相比，在G4PAMAM/VEGFASODN转染后的MDA-MB-231细胞中VEGF蛋白表达减少。

2.3乙酰肝素酶（HPSE）乳腺癌的预后与侵袭和转移密切相关，细胞外基质（ECM）和基底膜（BM）在肿瘤的侵袭与转移过程中起屏障作用。

HPSE是唯一的哺乳动物的糖苷内切酶，可降解ECM和BM中的HS，它的活动与肿瘤的转移、血管生成，及癌症病人术后的存活率密切相关。

Zhang L等证实人上皮生长因子受体2(HER2)/上皮生长因子受体（EFGR）表达的乳腺癌脑转移病人中，HPSE存在并表现出功能活性，与HER2状态相关联,并有潜力成为乳腺癌脑转移治疗干预的靶点。

张友磊等设计合成HPSE ASODN，并用阳离子脂质体Lipofectin包埋后转染人乳腺癌MDA435细胞，并建立人乳腺癌裸小鼠皮下侵袭模型和急性血路转移模型检测HPSE mRNA表达和HPSE蛋白表达的变化，计数裸小鼠肺表面肿瘤转移结节数目。

结果显示，HPSE ASODN通过下调HPSE mRNA和蛋白表达可显著抑制乳腺癌细胞的侵袭转移和血管生成。

2.4端粒酶（telomerase）Muller和McClintock发现真核细胞线性染色体末端有一特殊结构，称为端粒，它是由简单重复富含G的DNA序列和端粒结合蛋白的组成的一种核蛋白复合物。

端粒酶则是由RNA和蛋白质构成的一种核糖蛋白体，它是一种能以自身RNA为模板，反转录合成端粒DNA重复序列从而延长端粒末端的特异性逆转录酶。

端粒酶复合体包括人端粒酶RNA(hTR)，人端粒酶逆转录酶（hTERT）等。

它在超过90%的乳腺癌中表达，但在邻近的正常组织中不表达，这使得端粒酶成为治疗乳腺癌的新靶点。

许多学者提出了以反义核苷酸封闭hTR,从而抑制端粒酶活性，达到抑制肿瘤的效果。

如Natarajan S等发现在抑制端粒酶表达中，用hTR反义寡核苷酸要比针对hTERT mRNA更为有效。

Li ZG等设计试验发现用2.0umol/l 的ASODN转染MCF-7细胞中端粒酶的活性以时间依赖方式显著减少，以致细胞凋亡。

2.5 Ki-67 Ki-67是一种核增殖标志基因，在核增殖细胞中表达，而不在休眠细胞中表达。

因此它与肿瘤的发生于发展密切相关，具有抑制凋亡、促进肿瘤细胞增殖的作用。

蔡会龙等检测了乳腺浸润性导管癌组织中Ki-67的表达，发现Ki-67蛋白与浸润性导管癌TNM分期密切相关。

Kausch I等利用Ki-67 mRNA 合成的反义寡核苷酸抑制肿瘤细胞的增殖，发现对Ki-67蛋白表达的反义抑制可能是一个抗肿瘤治疗合理途径。

汪蕊等构建Ki-67反义核酸载体，并研究阻断Ki-67基因的表达对MDA-MB-435s细胞生物学行为的抑制效应，发现转染Ki-67反义核酸载体组的MDA-MB-435s细胞Ki-67mRNA和蛋白表达明显低于对照组，且细胞增殖首抑制，体外侵袭能力也明显降低。

2.6 HER-2 HER-2是EGF受体家族的成员，定位于染色体17q12-21.32上，编码相对分子质量为185000的跨膜受体样蛋白。

HER-2参与细胞生长增殖。

在≥50岁的早期乳腺癌患者中，肿瘤分级和种类与HER-2表达密切相关。

并且在15%—30%的乳腺癌病例中，HER-2过度表达，并与较差的预后和短存活时间相关。

Sun JZ等针对HER-2 mRNA探究反义寡核苷酸对乳腺癌肿瘤生长的抑制作用。

方法是将过度表达HER-2的乳腺癌细胞株SK-BR-3皮下注入BALB/c裸鼠中。

使用HA6722反义寡核苷酸，时间和剂量为变化量，观察肿瘤抑制率。

结果发现针对HER-2 mRNA的反义寡核苷酸以特异性序列和剂量依赖的方式对乳腺癌的生长进行抑制。

ASODN作为一种新的分子生物学工具及基因治疗手段，在治疗乳腺癌的应用中受到越来越多的重视，但仍有许多问题需要解决，比如如何提高转染率，如何选择特异性靶点，如何提高ASODN与靶点的亲和力，如何防止细胞内酶对ASODN的降解等。

但我们相信随着ASODN技术的发展，ASODN的应用必将成为临床治疗肿瘤的有效途径。

参考文献[1]张静，姜藻.反义寡核苷酸抑制Survivin表达来增强乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231对多西他赛敏感性的研究[N].东南大学学报（医学版），2009-2 28（1）.[2]扈煜，黎莉等.Survivin反义寡核苷酸转染对人乳腺癌细胞系MCF-7生长及对长春瑞滨的增敏作用[N].山东大学学报（医学版），2009，Jan;47(1).。