4.如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？ 知识拓展
融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是 杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体 的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀 释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通 过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体 （常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原 结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来 自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般 需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细 胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。
5、研究单克隆抗体治疗癌症的思路是（
A．利用单克隆抗体特异性地对抗癌细胞 B．以单克隆抗体作抗癌药物杀死癌细胞 C．抗癌物质在克隆细胞中大量合成
练习：
）
D．单克隆抗体携带抗癌药物特异性地与癌细胞 结合
练习：
6．只能使动物细胞融合的常用诱导方法（ A．PEG B．灭活的病毒 C．电刺激 D．离心 ）
练习：
1、动物细胞融合和植物原生质体融合比较， 在动物细胞融合中有特殊性的是（ A、融合的原理 C、融合的诱导手段 ）
B、融合的优点 D、融合的过程
练习：
2、动物细胞融合的目的中最重要的是（ ）
A、克服远缘杂交不亲和
C、培育新物种
B、制备单克隆抗体
D、生产杂种细胞
练习：
3、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合， 得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗 体，与骨髓瘤细胞融合的是（ A、经过免疫的B淋巴细胞 B、不经过免疫的T淋巴细胞 C、经过免疫的T淋巴细胞 ）
杂交细胞
灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面
细胞膜被病毒颗粒穿通 细胞膜连接
细胞融合，形成杂交细胞
（细胞膜具有一定的流动性）
(三)动物细胞融合的应用
1.突破有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为 可能。
鼠—鸡、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、
人—鸡、人—蛙、酵母菌—鸡 、人—胡萝卜等
2.成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物 新品种培育等的重要手段。 3、重要用途：制备单克隆抗体。
杂交瘤细胞既能迅速大量繁殖，又能产生 专一抗体。
1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有 什么不同？ 植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相 同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁， 然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融 合。 诱导融合方法不同：动物细胞诱导融合所用的方 法比植物体细胞杂交多一类灭活的病毒诱导；结 果不同：植物体细胞杂交培养成了杂种植株，而 动物细胞融合只培养出了杂交细胞。
获得能产生相应抗体的 注射抗原的目的是 B淋巴细胞（浆细胞） 什么？
如何进行筛选？ 具有筛选作用的培 养基（HAT培养基）
杂交细胞
⑥分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立 ⑦单克隆抗体的大量制备 如何获得大量的 单克隆抗体？
BB 、B瘤 、 ？种 瘤瘤 、
抗原 ？
（AA型、BB型）
效应B细胞 ？
筛选
AB型杂交瘤细胞
3.为什么不只用两个而要用多个细胞进行动物细胞 知识拓展 间的融合？
就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学 的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅 用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。 更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研 究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价 值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体 为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体 种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一 种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B淋巴细胞）和 一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否 正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合， 就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
1、把某种抗原反复注射到动物体内，然后 从动物血清中分离出所需的抗体。 2、缺点：
产量低，纯度低，特异性差。
人们发现，在动物发生免疫反应的过程中， 体内的B淋巴细胞可以产生多达百万种以上 的特异性抗体，但是每一个B细胞只分泌一 种特异性抗体。要想获得大量的单一抗体， 必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群。
3、有什么办法让B淋巴细胞也具有这样的能力？
细胞融合
２、实验原理：
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
柯勒
单克隆 动物细胞培养技术 杂种细胞 动物细胞融合 抗体 既能产生特异性抗 体，又能大量繁殖 创始人：米尔斯坦
如何大量生产单克隆抗体？
•利用B淋巴细胞产生抗体的功能。 •利用肿瘤细胞无限增殖的特性。 •利用细胞融合的技术将两种细胞 融合获得具有B淋巴细胞和肿瘤细 胞特性的杂交瘤细胞。 •利用动物细胞培养技术大量培养 杂交瘤细胞。
二、单克隆抗体
什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生的、 并能与该抗原发生特异性结合的具有 免疫功能的球蛋白。
1、抗体是由何种细胞产生的？
浆细胞（效应B细胞）
2、抗体是如何产生的？ 三、单克隆抗体
抗原
B淋巴细胞
增殖分化成浆细 胞
3、一种B淋巴细胞能产生 几种抗体？ 一种
（一）获得抗体的传统方法
思考与探究
2.制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细 胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？
哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B淋巴细 胞，B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗 原。动物在免疫反应的过程中，每一种B淋巴细胞能 分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体， 必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋 巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖； 骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无 限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞 与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会 兼有两个亲本细胞的特性──在体外培养条件下能不 断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。
9. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞 诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在 这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ C ） ①淋巴细胞 ②小鼠骨髓瘤细胞 ③B淋巴细胞自身融合细胞 ④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 ⑤杂交瘤细胞 A． ②④ C． ①②③④ B．①③⑤ D．②③
在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤 细胞的情况下，培养得到的细胞群是单个 杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体 必然是化学性质单一的，特异性强的单克 隆抗体。这里的单克隆确有单个细胞克隆 的含义，只不过克隆的不是B淋巴细胞，而 是杂交瘤细胞。
⑵.诱导方式：
是什么？
物理法：电激、振动、离心 2、动物细胞融合的诱导
方式是什么？与植物细胞 化学法：聚乙二醇（PEG） 融合的诱导方式有什么不 生物法： 灭活的病毒 例如：仙台病毒 同？
丧失感染性 （不感染细胞） 仙台病毒
紫外线 保留融合活性 （诱导细胞融合）
细胞A
物理法 化学法
细胞B
灭活的病毒
D、不经过免疫的B淋巴细胞
练习：
4. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞 诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞， 在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ ） ①淋巴细胞 ②小鼠骨髓瘤细胞 ③B淋巴细胞自身融 合细胞 ④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 ⑤杂交瘤细胞 A． ②④ B．①③⑤ C． ①②③④ D．②③
知识回顾
一、原理：
细胞膜具有流动性 植物细胞杂交 技术利用什么 细胞的全能性 原理？ 用什么方法可 二、诱导方法： 以诱导植物细 胞融合？ 电刺激、聚乙二醇 三、用途： 植物细胞杂交 技术有什么用 获得杂种植株 途？
？Байду номын сангаас
？ ？
脱分化
？
再分化 ？
一、动物细胞融合
有些细胞的融合是正常的生命活动。如 精子与卵细胞的结合。
1、请从以上文字资料中找出单克隆抗体的概念 用单个B淋巴细胞进行（无性繁殖）克隆，得到的 基因型相同的细胞群能够分泌一种化学性质单一、 特异性强的抗体，这种抗体就叫做单克隆抗体。
思考：
1、在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞有没 有可能无限增殖？ 不可能 2、我们学过的什么细胞具有这样的能力？
癌细胞
2、在这过程中进行了几次筛选？分 别在哪个步骤进行筛选？ 两次筛选。第一次在B细胞和骨髓瘤 细胞融合以后筛选出杂交瘤细胞； 第二次在杂交瘤细胞中筛选出能产生 所需抗体的杂交瘤细胞。
四、单克隆抗体的应用
１可用于作为诊断试剂：有准确，高效，快速的优点 ２可用于疾病治疗 请同学们根据自己所收集 ３可用于运载药物（作为运载对应疾病的药物的 “生 的资料，谈谈单克隆抗体的应 物导弹“。） 用。 “生物导弹”＝单克隆抗体＋药物
筛选
能产生所需抗体的细胞
抗原
过程：小鼠
效应B细胞
细胞融合、筛选
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
多孔培养板单个 细胞培养，筛选
能产生特定抗体的 细胞群 体外培养 体内培养 提取出单克隆抗体
1.在制备单克隆抗体的过程中，选用 哪两种细胞进行融合？为什么选择这 两种细胞？ 浆细胞和骨髓瘤细胞 浆细胞能产生单一抗体，但不能无限 增殖；骨髓瘤细胞能无限增殖，但不 能产生单一抗体。
7、“生物导弹”是指 （ ） A.单克隆抗体 B.杂交瘤细胞 C.产生特定抗体的B淋巴细胞 D.在单抗上连接抗癌药物
练习：
8、下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中， A 不正确的是（ ） A．B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般不 需要灭活的仙台病毒或聚乙二醇诱导 B．融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又 能产生单克隆抗体 C．体外培养时，一个效应B淋巴细胞可以产生 抗体，但不能无限增殖 D．单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵 敏度高，优越性明显