监测到的环境菌株
头状葡萄球菌头状亚种（Staphylococcus capitis ssp capitis） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus） 缓症链球菌（Streptococcus mitis） 科氏葡萄球菌科氏亚种（Staphylococcus cohnii ssp cohnii） 藤黄微球菌（Micrococcus luteus） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）。
人员
原料
辅料
药品（食品）
药品食品生产过 程中可能污染微 生物的主要环节
环境
设备
实验人员
培养基
药品食品微生物检 查过程中可能污染 微生物的主要环节
待检样品 实验环境
检验结果 实验器材
实验操作——物料进场
消毒液搽拭 物品外表面
外围
洁净传递（风 淋、紫外照射 ）
实验操作——人员进场
一更
二更
实验操作——无菌操作技术
（一）、实验准备
实验准备应坚持“平战结合”，物质准备有备无 患，应随时保证“来之能战” 。
尤其注意常备有效期要求的物品：培养基、 冲洗液、滤器、小型实验器材等。
实验准备——无菌室专用酒精棉球制备 实验准备——场地清洁 实验准备——台面清洁
（二）、样品核对
尽快取得样品，确保样品传递过程中的 完整性、安全性、有效性；
BD鉴定 B.pumilus M.luteus / C.urealyticum K.kristinae C.urealyticum S.caprae S.caprae S.warneri S.epidermidis S.warneri S.warneri S.capitis S.epidermidis
1、长菌与否？
浑不浑浊? 物理变化、化学变
化还是生物变化？
一靠经验 二靠实验 三靠严格程序控制避免干扰
是不是微生物？
（1）、液体培养基浑浊 物理变化？化学变化？生物学变化？
（2）、平板上的菌落 琼脂表面、琼脂中、琼脂和平皿夹层 菌落or药渣？
菌落or药渣？
经60Coγ射线大剂量照射再检验 延长培养时间到7天 重新划线培养 镜检
2、粘质沙雷菌（Serratia marcescens） 1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae
ssp pneumoniae）； 2、粘质沙雷菌（Serratia marcescens）
1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）；
图 不同来源的阴沟肠杆菌红外图谱聚类关系
The Infrared Spectrum
Biochemical Structure of Cells
cell wall capsules DNA, RNA
flagellates, pili
ribosome
vacuoles
...
water salts carbohydrates lipids
搽拭
实验菌株 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌
菌液计数 19 64
回收计数 18 60
回收率 94.7% 93.8%
菌液稀释、分液的误差为：5.5% 表面搽拭操作的回收率大于 99%
（三）、关键设备
• 微生物检查薄膜过滤仪 • 一次性薄膜过滤培养器 应急检验用一次性薄膜过滤培养器
（四）、对照培养基
• 培养基适用性（灵敏度）； • 培养基性能稳定性（标准化）。
2、分离鉴定
（1）立即转接2ml该培养物至相同的培养基中 继续培养；
（2）取5支冻存管，每管分装1ml浑浊培养物 ，-80℃保存；
（3）取浑浊培养物在TSA平板/血琼脂上划线 ，分离污染微生物；
（4）如果发现硫乙醇酸盐流体培养管变浑浊 ，还应增加血平板划线，并在厌氧条件下培养 分离厌氧菌。由平板分离到的菌落应进一步鉴 定，并逐一保藏。
对照培养基
理化评价（可控性）
生物学评价（有效性）
固态培养基
液态培养基
某些CRS原则
回收率比较 生态评价
琼脂加减法
MPN比较 生长曲线比较
二、检验程序
环境保证
培养基保证
无菌性检查 灵敏度检查
SOP操作
有效的方法
方法验证
有效的结果 可靠的结论
结果判断
二、检验程序
接受任务 实验方案 实验准备 样品核对 实验操作 过程监控 培养观察
环境菌库
洁净环境常见菌（浮游菌）：
头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus） 缓症链球菌（Streptococcus mitis） 科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii） 藤黄微球菌（Micrococcus luteus）
溯源性分析例2
DuPont RiboPrinter基因指纹分析
几点思考
（1）、怎样才算是同一株菌？
需要深入认识微生物本身 微生物变异与保守的相对性； 分析方法的可变性与微生物本身的可变性；
生物学先锋琳恩·马古利斯(Lynn Margulis)曾表示：“如果将一个特殊的
洁净实验条件的维护、验证
阳性菌实验室达到P2生物安全标准
实验室改造示例：原布局图 拟定布局图 建议布局图1 建议布局图2
实验室系统——中检所微生物实验室
（一）、实验室系统
实验室系统的管理与维护： 1、屏障系统的有效性
压差、风速、微粒、照度 （外包服务合同） 2、清洁、静态与动态监控、熏蒸 3、环境菌库 酒精棉球分离微生物 新洁尔灭分离微生物
相似性分析 同源性分析
脉冲场电泳（PFGE）、傅立叶红外（FTIR ）
Sample Preparation
1. Harvesting 2. Suspending
3. Loading
Automated measurement after drying of the samples!
FT-IR Spektrum of microorganisms
308L 308G 309L 309G 304G
滤筒中形态 浑浊，产气
浑浊，剧烈产气
致密片状、絮状物，振摇不散 颗粒状悬浮物，振摇能散 浑浊，产气
浑浊，产气
浑浊，产气
浑浊，产气 浑浊，产气 浑浊 致密片状、絮状物，振摇不散 浑浊 致密片状、絮状物，振摇不散 浑浊
革兰染色 1、G-球杆菌 2、G-短杆菌
2、粘质沙雷菌（Serratia marcescens） 1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae
ssp pneumoniae）； 2、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae） 1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae
ssp pneumoniae）； 2、粘质沙雷菌（Serratia marcescens） 肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp
（二）、操作环境
1、隔离器 2、生物安全柜 3、超净工作台
（二）、操作环境
分类 隔离器 生物安全柜
样品安全
？
？
超净工作台
人员安全
环境要求
点评
验证困难，灭菌不彻底：假阳性 灭菌剂残留：假阴性
动态验证困难，不适合多任务的 检验活动
经典、廉价、适合多任务的检验 活动。提高实验室新风供给、加 强实验室监控可以扬长避短
1、G-球杆菌 2、G-短杆菌
G+长链杆菌（液体培养物直接涂片） G+长链杆菌（液体培养物直接涂片） 1、G-球杆菌 2、G-短杆菌
1、G-球杆菌 2、G-短杆菌
1、G-球杆菌 2、G-短杆菌
G-球杆菌
G-球杆菌
G+长链杆菌（液体培养物直接涂片）
G+长链杆菌（液体培养物直接涂片） G-杆菌
BD鉴定
1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）；
pneumoniae） 肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp
pneumoniae） （Alcaligenes faecalis）
（Alcaligenes faecalis）
嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）
溯源性分析例1——欣弗事件
仔细核对样品及样品资料，高度关注媒 体公布样品（问题样品），同时尽量获 取非问题样品及同类样品，进行比较实 验、比较分析；
样品外观检查、完整性检查。
样品外观检查——欣弗 样品外观检查——刺五加 样品外观检查——双黄连
样品完整性真空检漏
（三）、实验操作
不断完善标准化操作规程（SOP），严格避免 实验室污染。
C.urealyticum
S.warneri S.epidermidis S.haemolyticus
菌株
C1524-F C1524-B C1526-F2
16sRNA鉴定
S. haemolyticus S. haemolyticus S. haemolyticus
可信度
99% 98% 100%
FTIR相似性分析
利巴韦林注射液
双黄连注射液
编号 走廊1 走廊2 走廊3 无菌室4 无菌室5 无菌室6 C1524-F C1524-B C1525-B1-1 C1525-B1-2 C1525-B2 C1525-F1 C1525-F2-1 C1525-F2-2
C1526-B1
C1526-B2 C1526-F1 C1526-F2