摘要：分子生物技术近几年来得到了飞速发展，广泛应用于环境微生物的研究，本文详细介绍了聚合酶链式反应技术，描述了PCR引物是什么以及PCR引物的设计原则，并且从硝化细菌方面，详细描述了PCR技术在污水处理方面的应用。
关键字：PCR引物，设计原则，硝化细菌，污水处理
Abstract:Molecular biological technology has been rapid developed in recent years, widely used in the study of environmental microbiology, This paper described polymerase chain reaction (PCR) technique in detail, and describe the principles of design PCR primers .Described The application of PCR technology in wastewater treatment .
Keywords:PCR primer, design principle, Nitrification bacteria, wastewater treatment
聚合酶链式反应(Polymerase chain reacLion,PCR)是20世纪后期发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术，具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间。
因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础f21。
近年来，该技术在相关领域得到了广泛应用，并大大推进了分子生物学和相关领域的研究和发展。
众所周知，引物设计是影响PC R试验的重要参数之一。
随着分子生物技术的发展，污水生物处理系统也随这发生了改进。
污水生物脱氮是污水处理中最重要的环节，共包括两个阶段:硝化和反硝化。
硝化阶段主要利用硝化菌进行处理，如氨氧化菌(AOB)、
亚硝酸盐氧化菌(NOB)等。
保证硝化细菌的存活和稳定繁殖是污水生物脱氮的关键所在。
所以，利用分子生物技术对硝化细菌的活性、分布等进行研究，可有效促进污水脱氮系统的稳定与发展。
目前，应用最多的分子生物技术是FISH技术(荧光标记的原位杂交)与PCR技术(聚合酶链式反应)。
1.1设计原则
2.2.1引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结
构，引物与模板的序列要紧密互补。
引物设计中，特别需要
判断引物互补配对情况是否影响模板与引物的结合，这需
要估计模板与引物结合及引物配对结合的自由能。
A,T 由2
个氢键连接，G,C由3个氢键连接。
一般来说，出现3个碱
基的序列互补便有些危险，尤其在引物3’末端。
若3’末端出
现3个碱基的序列互补或碱基为GC的2个碱基的序列互
补，只好将这个引物放弃，重新设计f}l
2.2.2在选择用来扩增不同物种DNA的引物时，应避开
mRNA 的5’和3’末端非翻译区序列。
不同物种mRNA
的5'
和3’末端非翻译区序列可能没有任何的同源性f}}l，如果选
择的不同物种DNA序列同源性非常低，那么就无法保证获
得一段或几段高度保守的序列，将会为引物设计带来很大得一段或几段高度保守的序列，将会为引物设计带来很大的困扰，特别是在BLAST比对和Primer Premier 5.0软件进
行评价分析时，各项参数指标将会远远达不到要求，无法充
分保证引物设计的高度敏感性和特异性，更会为后期的RT-
PCR试验带来诸多麻烦。
2.2.3不同类型引物设计的特别原则。
特异性引物的错配
率很低，甚至为零，其中，RT-PC R引物最好跨过1个以上的
内含子序列;非特异性引物的扩增位点数要在合适范围内;
简并性引物的简并性要合适等。
2.PCR技术的应用
2基于PCR技术的分析方法
在以往的检测方法中，人们通常是从污水中提取硝化菌，但这种硝化菌的DNA含量很低，为检测工作带来了很大麻烦。
而PCR技术能够大量扩增DNA片段，从而解决了上述问题。
2.1 amoA基因与16SrRNA基因
如果想要实现硝化菌DNA序列的扩增，首先应提取一段硝化菌带有进化标记的DNA序列，找出该序列的保守区，制作出与之匹配的探针。
氨氧化菌的带有进化标记的基因一般是amoA基因与16SrRNA基因。
2.1.1 amoA基因
amoA基因是编码氨单加氧酶的一种基因，编码氨单
加氧酶是氨氧化菌独有的胞内酶，共有三个基因，分别是amoA , amoB , amoC，而amoA中含有编码氨单加氧酶的活
性位点能够将铰催化成轻胺，为氨氧化菌的成长供应能量。
一个氨氧化菌中含有2}3个amoA，不同的amoA功能
也不一样。
2.1.2 16SrRNA基因
研究人员对16SrRNA基因的研究具有划时代的意义，增加了人们对微生物生长的认识。
16SrRNA基因有
很强的保守性，根据微生物中16SrRNA基因的不同可以将微生物分为两类，古细菌和细菌。
许多书籍中对微生物的命名都是根据不同的16SrRNA基因分析的。
一个氨氧化菌中只有一条16SrRNA基因，而不同的氨氧化菌的16SrRNA基因也不完全相同，从这些差异中可以看出不同氨氧化菌的关联与进化差异。
有关专家对不同氨氧化菌中的amoA基因和
16SrRNA基因的排列顺序进行研究后发现，大部分氨氧化菌的amoA基因或16SrRNA基因的系统发育树都比较相似，正是由于这一相似性，导致用16SrRNA基因制作的
探针检测的精确度受到影响。
而amoA由于只在氨氧化菌中存在，尽管它对系统发育树影响不大，但由于它的差
异性使得利用amoA基因制作的探针精确性与特异性比16SrRNA基因要强，能准确地辨别氨氧化菌的种属。
目前，这两种探针都只能在自养型氨氧化菌中使用，而无法
对实际污水中种群的多样性进行分析。
2.2 PCR一变性梯度凝胶电泳克隆测序技术
PCR一变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术是将利用PCR技术扩增的DNA片段植人到凝胶中进行电泳的
一种技术。
凝胶一般是聚丙烯酞胺凝胶，且加人了梯度变性剂，一般是尿素和甲酞胺。
利用PCR技术扩增的
DNA片段长度是可控的，可以保证长度的一致性，但是DNA内部的碱基排列却有所不同。
在进行电泳时，不同的碱基排列会根据梯度变性剂浓度的变化而发生变性，电泳速度越来越慢，最终各自停留在相应的位置，之后在
对其进行染色，凝胶上就会出现若干条DNA谱带，一条谱带就是一个DNA片段。
而这种方法经常会受到单链
DNA、探针特异性等的影响，导致检测结果不准确。
为了
避免这一影响因素，研究专家经常会在测验后再进行
Cloning(克隆)和Sequencing(测序)，以对检测结果进行
进一步确认，即所谓的PCR-DGGE-cloning-sequencing
(PCR一变性梯度凝胶电泳克隆测序技术)。
研究人员利用此技术对污水处理系统内硝化菌群进
行了研究，发现在污水处理过程中，氨氧化菌的数量是不
会改变的。
但是若受到外界因素(如温度、水质)的影响，氨氧化菌的种群结构会发生较大的改变。
研究人员在研究曝气对污水中硝化细菌的结构与脱氮效率造成的影响
时注意到，供氧时间的长短对污水中硝化菌的种群结构
会产生一定的影响。
经过研究，脱氮效率与氨氧化菌的
含量以及种群多样性并无关系。
利用PCR一变性梯度凝胶电泳克隆测序技术能够清晰的展示污水处理中硝化菌的种群结构和数量的变化。
然而，凝胶中DNA片段的碱基对一般不超过500，这一片段的序列又要与检测序列的重合度大于85%，否则就不能
对硝化菌进行准确的分类，无法收集有关硝化菌的数据。
另
外，此技术的灵敏度不高，凝胶配置浓度不容易掌握，导致
此技术对微生物含量少的种群没有理想的检测
能力。
结论：
3.1分子生物技术从细微层面研究了影响污水处
理系统中硝化菌生长的条件。
3.2在未来的发展中，应完善分子生物技术研究时
的具体操作流程，积极引进新技术、新方法，提高检测的
准确性以及特异性，PCR技术的操作流程应进一步完善，
使其能更精确地反映出微生物种群活性与外界环境的关系。
相信在未来的污水处理中，分子生物技术会随着科技的进步，研究方法更方便快捷，在对污水处理系统的检测中更为稳定、精确。
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