淀粉酶：淀粉（底物）+ 碘液（指示剂） 氨基酰化酶：N-乙酰氨基酸（底物）+溴甲酚紫（指示剂） 溴甲酚紫，pH >6.2显紫色；pH <4.8显黄色
2020/3/20
（2）培养简便、繁殖快、发酵周期短， 能控制培养条件大幅度提高酶的产量。
（3）微生物易变异，可采用各种遗传变 异手段，培育出新的、更理想的菌株。
2020/3/20
4
二、 微生物新酶的获取途径
获取途径
购买商品化的酶 购买产酶微生物 从自然界筛选产酶微生物 从基因克隆库中筛选酶基因
2020/3/20
5
2020/3/20
20
富集培养方法
（4）稀释培养法
长期生长在营养贫乏的环境中的微生物对过高 浓度的有机质敏感，生长受到抑制，可用稀释后 的培养基进行富集培养。
2020/3/20
21
四、 从自然界筛选产酶微生物
3、菌株分离纯化
富集培养获得具有生长优势的菌株，但其他菌 株依然存在，需要用合适的方法加以分离
2020/3/20
19
富集培养方法
（3）抑制不需要的菌类
通过高温、高压或加入抗生素等抑制剂减少非
目的微生物的数量
高温处理（80℃）筛选芽孢菌 抑制细菌：加入青霉素（G+）、链霉素（G-）、四环素、金霉素、
孟加拉红等
抑制放线菌：青霉素、卡那霉素，安普霉素，壮观霉素等 抑制真菌：纳他霉素、井冈霉素或者制霉菌素，或者两性霉素等
国内外主要菌种保藏机构：ATCC、DSMZ 、 CCTCC、CICC、CGMCC
特点： 方便易得，成本较低（600-800元/株） 需要进一步筛选
2020/3/20
7
3、 从自然界筛选产酶微生物
从土壤、水体中筛选产酶微生物
广泛采用，盲目，工作量大
2020/3/20
8
3、 从自然界筛选产酶微生物
（1）种类繁多、分布广
微生物“无孔不入，随遇而安” 微生物具有多样性
① 物种多样性：据估计总类别在50万至600万之间 ② 生理代谢类型多样性：有机物和有毒物质分解、转化 ③ 遗传基因多样性：已完成测序细菌1214种、古细菌93种、
真菌17种（2010年数据）
2020/3/20
3
微生物作为酶源的优点
方法：多孔板培养微生物，并用酶标仪进行光 谱分析。
原理：反应产物具有吸收峰值，发光或产生荧 光。
2020/3/20
14
四、 从自然界筛选产酶微生物
筛选流程
调查研究 查阅资料
采样
富集培养
分离纯化
性能鉴定
优质菌株
生产性能、毒性、菌种鉴定
筛选
初筛、复筛
纯种斜面
诱变育种
生产应用
2020/3/20
15
从基因克隆库筛选
克隆库构建方法：
基因组狩猎 基因挖掘 宏基因组筛选
2020/3/20
9
三、 新酶筛选的策略
新酶筛选的一般规律（原则）
筛选前回答三个问题
明确反应目标：筛选什么酶？ 在合适的微生物群体中筛选：从哪里筛？ 确立高效筛选方法：用什么样的筛选方法？
2020/3/20
10
三、 新酶筛选的策略
2020/3/20
12
三、 新酶筛选的策略
3、筛选方法
（1）分级筛选法
初筛：迅速定性或粗略定量鉴别，除去大多数 不符合要求的菌种或酶。平板筛选法、多孔板 法等
复筛：精确测定酶活，筛选出需要的酶或产酶 微生物。常采用HPLC或GC
2020/3/20
13
三、 新酶筛选的策略
3、筛选方法
（2）高通量筛选法
四、 从自然界筛选产酶微生物
1、样品采集
方法：根据所要实现的化学反应确定需要的酶 及产酶微生物的类型，选择采样环境
土样采集方法：除去表层土，取离地面5~15 cm处的土样，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中， 扎紧，标明时间、地点、天气和周围环境等信 息。
2020/3/20
16
四、 从自然界筛选产酶微生物
2、富集培养
目的：使目的菌株大量繁殖，成为优势菌株 原理：根据微生物的特点，“投其所好”或
“取其所抗”，在培养基中投放或添加特殊养 分或抗菌物质，使天然环境中劣势菌转变为人 工环境中的优势菌。
2020/3/20
17
富集培养方法
（1）控制培养基的营养成分
在培养基中加入一定量底物，筛选生长优势菌株
酶工程 第十章 新酶的发现与筛选
2020/3/20
1
一、 新酶的来源
ห้องสมุดไป่ตู้
酶筛选的任务：
寻找包含所需酶活性的微生物菌株，或编码所 需酶的基因，以实现特定的生化反应。
酶的来源： ① 动物细胞、组织液或分泌物； ② 植物细胞、组织液或分泌物； ③ 微生物细胞（主要，80%以上）
2020/3/20
2
微生物作为酶源的优点
1、 购买商品化的酶
向酶制剂供应商购买商品化的酶
世界主要酶制剂供应商：Sigma、Novo Nordisk、 ThermoGen、Roche Molecular Biochemicals 等
特点： 方便易得，可大量供应 种类少、成本高、知识产权问题
2020/3/20
6
2、 购买产酶微生物
从菌种保藏库购买酶来源微生物
分离纯化方法：稀释涂布或划线分离
2020/3/20
22
四、 从自然界筛选产酶微生物
4、初筛
平板筛选法 薄层层析法 高通量筛选法
2020/3/20
23
1、平板筛选法
（1）变色圈法
将指示剂掺入固体培养基中进行待选菌悬液的 单菌落培养，或将指示剂喷洒在平板单菌落表 面，指示剂与底物或产物反应，在菌落周围形 成变色圈。
加入底物作为唯一碳源或氮源
逐步提高底物添加浓度，连续富集培养
用不同的培养基筛选不同类型的微生物
细菌：牛肉膏蛋白胨培养基 放线菌：高氏一号培养基 霉菌：察氏培养基 酵母：豆芽汁培养基
2020/3/20
18
富集培养方法
（2）控制培养条件
控制培养pH、温度及盐浓度等 细菌、放线菌（pH7.0~7.5） 霉菌、酵母菌（pH4.5~6.0） 筛选嗜热微生物：高温 筛选嗜盐微生物：NaCl 15%~20%
1、筛选什么样的酶
根据需要实现的化学反应，选择所需酶的类型 了解化学反应对于酶性质的要求，比如对温度、
pH、盐浓度等的耐受力等
2020/3/20
11
三、 新酶筛选的策略
2、从哪里筛
主要筛选对象：水体和土壤
采集场所：
淀粉酶产生菌：面粉厂周围 纤维素酶产生菌：腐败树叶层下 脂肪酶产生菌：油脂厂附近 蛋白酶产生菌：蚕丝、豆饼等腐败变质的地方 嗜极微生物：火山口、盐碱地、深海、极地冰层下等