河北师范大学生命科学学院2011级生物科学专业细胞生物学实验论文题目：洗洁精、甲醛对蚕豆根尖细胞的微核诱导及检测班级： 2011级生科3班小组成员：肖祖文郭志雷赵怡璇谷维佳指导老师：赵红桃尚建秀时间：2013-11-23目录摘要：.................................................................................................... - 3 -1、背景与研究目的 ............................................................................. - 3 -2、材料与方法： ................................................................................. - 4 -2.1材料............................................................................................ - 4 -2.2方法............................................................................................ - 4 -2.2.1材料准备： ...................................................................... - 4 -2.2.3染毒处理： ...................................................................... - 4 -2.2.4恢复培养：...................................................................... - 4 -2.2.5根尖处理： ...................................................................... - 4 -2.2.6染色、压片和镜检计数: ................................................. - 5 -2.2.7预期结果 .......................................................................... - 5 -3、结果及分析...................................................................................... - 5 -4.讨论..................................................................................................... - 6 -4．1实验结果分析 ........................................................................ - 6 -4.2下一步实验改进 ....................................................................... - 7 -4.3心得体会： ............................................................................... - 7 - 参考文献................................................................................................ - 8 -洗洁精、甲醛对蚕豆根尖细胞的微核诱导及检测摘要：根据微核诱导的原理，以未受污染的蚕豆和家用洗洁精、甲醛为材料，测定此二种物质对蚕豆根尖细胞的毒性。
结果表明：洗洁精不会诱导微核的产生，而甲醛会诱导出根尖细胞微核。
说明甲醛具有一定毒性，而家用洗洁精、在一定浓度范围内对生物细胞是无害的。
关键词：洗洁精、甲醛、蚕豆、微核、诱导1、背景与研究目的蚕豆根尖微核（micronucleus，MCN）检测系统自1982 年由Degressi 等[1]建立以来，以其简单、快速等特点，受到了研究者的高度重视[4-8]。
目前，该系统已经成熟地应用于水污染监测领域[2-3]，如早在1986 年国家环境保护局就将蚕豆根尖微核检测技术列入了《环境监测技术规范》用于水环境监测。
但是，蚕豆根尖微核检测技术在空气污染监测领域的应用相对较少。
甲醛是已经被世界卫生组织确定为致癌和致畸形物质，国际癌症研究机构（IARC）已经于2004 年将甲醛上升为第一类致癌物质，甲醛已成为我国新装修家庭中的主要污染物[9-10]。
随着日用化学工业的发展，各类家用洗洁精和洗衣粉相继问世，其种类和产量与日俱增，并己被广泛应用于日常生活中，人们洗涤瓜果、蔬菜、餐具、衣物等直接或间接地造成环境污染，尤其是水源污染及食物残留，影响人类的健康，已经越来越引起人们的关注。
蚕豆根尖细胞微核技术是一种以染色体损伤及纺锤丝毒性等为测试终点的植物体细胞检测方法，因具有材料方便，培养简单、技术容易掌握、准确、快速、有明显剂量效应等优点而成为目前研究和应用较多的检测环境污染物质的检测系统。
甲醛是一种广泛应用的化工原料和有机溶剂,在装修材料中广泛存在的一种无色刺激性气体,对皮肤和粘膜有强烈刺激作用,能引起视力和视网膜的选择性损害,甲醛可引起“不良建筑综合征”和“眼鼻咽喉刺激症”[11]。
甲醛已被世界卫生组织确定为致癌和致畸型物质，已成为我国新装修家庭中的主要污染物。
本实验主要是研究水污染中洗涤剂不同浓度对微核的产生的影响和探索应用蚕豆根尖细胞微核试验检测室内环境甲醛污染的可能性。
2、材料与方法：2.1材料洗洁精（立白）、甲醛、蚕豆种子、蒸馏水、卡诺固定液、1mol/L 的盐酸、改良碱性品红染色、载玻片、盖玻片、小烧杯、解剖器、EP管、普通光学显微镜、胶头滴管、瓷盘。
2.2方法2.2.1材料准备：取蚕豆种子在蒸馏水中浸泡24h[12]，使种子充分吸胀，置于有滤纸的瓷盘中并盖上湿纱布，在23±1℃的光照培养箱中培养l～2 d，使其长出1.5～3.0cm长的初生根，此时切除初生根以保证侧根的生长发育。
2.2.2毒液准备：（1）一定量正常洗衣服后的洗衣水20ml；（2）浓度为分别25%、50%的洗洁精溶液各20ml；（3）浓度分别为0.50%的甲醛溶液20ml；2.2.3染毒处理：待侧根露白后，分别取一粒蚕豆种子浸入配制好的不同浓度的等体积(20ml)的用小烧杯盛放的毒液中进行染毒，同时用等体积蒸馏水做空白对照，蚕豆根部一定要完全浸入毒液，染毒时间为6小时。
（阳性对照：用50mmol/L 的NaN3溶液，但考虑到NaN3毒性较大，在本科实验室实施比较困难，将其去除。
以老师给的图片上微核作为阳性对照）2.2.4恢复培养：12小时后将染毒后的蚕豆根用蒸馏水依次清洗3次，每次约2分钟，然后将蚕豆根置于蒸馏水中恢复培养24小时。
2.2.5根尖处理：从染毒后的蚕豆根上切下 1-1.5cm 长的根尖3至5个放于EP管中，用卡诺固定液(3 份无水乙醇与 1 份冰醋酸混合)固定12h[13],卡诺固定液要将蚕豆根尖全部淹没，12小时后用蒸馏水冲洗 3 次, 每次约 5min, 然后将蒸馏水倒出，加入1mol/L 的盐酸，盐酸容量要将根尖全部淹没，在 60°C下恒温解离 5-10分钟, 直至根尖软化, 之后再用蒸馏水反复冲洗 3-4 次，直至将盐酸冲洗干净。
2.2.6染色、压片和镜检计数:从处理好的根尖上切取 1mm 左右的根尖(注意区分根的尖端和上部的伸长区，取的是根尖的部位)，放在干净的载玻片上, 用解剖针将根尖捣碎, 用改良碱性品红染色 10min, 然后加盖玻片, 轻轻敲打压片, 使根尖细胞分散。
每个处理取3－5个根尖，每个根尖观察至少200 个细胞, 记录微核细胞数, 在40×10倍显微镜下，凡小于主核1/4以下的，同主核有相同染色效果的，圆形、椭圆形或其他类似的形状的染色物质都可以算作微核。
最后计算微核千分率(MCN%)。
微核率与污染指数计算公式如下：微核率(MCN‰) =微核个数/观察细胞总数×1000‰污染指数(PI)=待测水样微核率/对照水微核率(蒸馏水)所得数据采用SPSS软件进行统计分析。
2.2.7预期结果（实验假设）空白对照组对蚕豆无害呈阴性，应该无或少数微核出现；污染物溶液具有毒性应呈阳性，所以预测细胞中微核出现较多；而不同浓度的样品中，由于样品浓度越大对蚕豆根的毒性越大，所以预计微核随着浓度的增加而增加。
然而，具体微核千分率需实验结果的统计。
3、结果及分析2.1实验结果：蚕豆根尖细胞微核的镜下形态和微核率在光学显微镜下可观察到细胞有丝分裂不同时期的微核现象，将镜下观察的蚕豆根尖细胞微核记数，并进行微核率统计．经t检验可知甲醛处理结果如下：表1甲醛浓度观察细胞数目出现微核细胞数目微核千分率（%）（个）（个）（‰）0.50 1000 6 60.10 1000 2 2箭头所示为微核洗洁精处理结果如下：表2洗洁精浓度观察细胞数目出现微核细胞数目微核千分率（%）（个）（个）（‰）0.50 1000 0 00.25 1000 0 0空白对照结果：无微核出现。
4.讨论4．1实验结果分析在进行甲醛诱变饰演的结果看来，当甲醛浓度升高时，蚕豆幼根细胞为微核率与低浓度甲醛处理相比略升高，无显著差异。
本实验甲醛处理后，有四个微核，微核率较低。
洗洁精实验没有微核出现，因为洗洁精浓度太大，所以导致细胞已死，再继续的试验已无意义。
本实验总体来说不算成功，因为只观察到甲醛处理过的根尖有微核出现，另外两个与预期结果不同，主要是因为浓度太大（0.1%浓度下，蚕豆根尖细胞的形态基本上与正常生活细胞一致，而在0.1%和0.5%浓度下，蚕豆根尖细胞形态变化很大，细胞核明显变形，细胞呈束状排列，核膜破损，根尖生长区细胞内呈一片粉红色，无法检测微核）。
蚕豆染色体大而少，它的根尖分生组织细胞增殖周期较短，一般为8～48 h，其中大部分时间又是对诱变剂敏感间期[14]。