中国科学技术大学
硕士学位论文
家蚕丝腺表达谱的分析及相关基因的表达研究
姓名：唐杰
申请学位级别：硕士
专业：生物化学与分子生物学
指导教师：周丛照
20070601
中国科学技术丈学硕ｔｚ论文第一章
第一章文献综述
第一节家蚕研究历史概述
家蚕是蚕蛾的幼虫（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｔ），属节肢动物门、昆虫纲、鳞翅目、蚕蛾科、家蚕属。

家蚕一个世代中，其个体发育需经历受精卵、幼虫、蛹、成虫的四个发育阶段，属完全变态。

家蚕只在幼虫时期取食桑叶，期阔一般蜕皮（ｍｏｌｔ）４次，在蜕皮过程中停止摄食的现象称为眠，眠是划分蚕龄（ｉｎｓｔａｒ）的界限。

第４次眠后的５龄蚕可以分泌蚕丝结茧，蚕丝（ｓｉｌｋｆｉｂｅｒ）是丝绸原料的主要来源，在人类经济生活中有着重要作用。

约在４。

Ｏ∞多年前中国已有文献记载，至少在３．０００年前中国人民已经开始人工养蚕。

家蚕分布全国。

由于蚕丝柔软、光滑、强韧、洁白，中国人民很早就懂得利用它来织造出质地精美的丝绸，并远销国外，开辟了约有２。

０００年历史的“丝绸之路”时代，对早期的全球化作出了贡献。

图１．１５龄期末期家蚕
Ｆｉ９１．１５ｔｈｉｎｓｔａｒｓｉｌｋｗｏｒｍ
家蚕不仅在养殖业和纺织业具有重大的经济价值，而且作为唯一真正的人工饲养的昆虫，家蚕的生长和繁殖完全依靠人类，故拥有其为数众多的突变和不育品系。

据不完全统计，目前最大的突变品系库在中国江苏科技大学，约７００种遗传种类；西南大学拥有约６００多种突变种类；日本京都大学和日本国立农业生物科学研究所各拥有４００多和４５０多种突变种类；韩国农业发展厅（ＲＤＡ，水源市）约拥有３５０多种。

所以早在十九世纪初，即近代生物学的开端，家蚕就已经成为微生物学、生理学和遗传学研究的模式生物。

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５５４个来自其他鳞翅目昆虫的已知基因的８２．７％．总共大小是４２８．７百万碱基对，分布在２８个染色体上。

小于当初ＣｏＴ分析预期的５３０百万碱基对，使得家蚕成为继黑腹果蝇、冈比亚按蚊后的第三种被测序的昆虫。

据最新的资料表明，综合两个独立研究组的家蚕基因组数据，覆盖度己达到９５％左右，重复度高达９倍。

随着家蚕基因组框架图的完成，国际鳞翅目基因组研究人员开始着手对全基因组序列中所包含的可能的基因的结构和位置进行鉴定。

目前依靠计算机预测软件，并结合基因结构的普遍规律和家蚕基因组的特殊性，中国的西南大学和中科院基因所联合小组最终预测了１８．５１０个家蚕基因。

同时国际上的家蚕全长ｃＤＮＡ文库的构建计划也在顺利的开展中（目前己达到２万余条）。

第二节家蚕丝腺研究背景
图１．２家蚕丝腺
Ｆｉｇ．１．２Ｓｉｌｋｗｏｒｍｓ¨ｋｇｌａｎｄ
家蚕左右两侧各有一个管状的丝腺（ｓｉｌｋｇｌａｎｄ），在纺丝管舍一。

丝腺是合成茧丝蛋白质和分泌蚕丝的重要生物器官，具有强大地合成和分泌蚕丝蛋白的能力。

一只家蚕一般经过２５天左右的生长发育，在幼虫期食下鲜桑叶约２２克，即可合成并分泌０．５～１克的丝蛋白。

丝腺从形态和机能上可分为前部丝腺
（ＡＳＧ，ａｎｔｅｒｉｏｒｓｉｌｋｇｌａｎｄ）、中部丝腺（ＭＳＧ，ｍｉｄｄｌｅｓｉｌｋｇｌａｎｄ）和后部丝腺（ＰＳＧ，ｐｏｓｔｅｒｉｏｒｓｉｌｋｇｌａｎｄ），其中前部丝腺没有合成和分泌的作用，是丝物质流经的导管；中部丝腺是整个丝腺中最粗大的部分，从形态上又可分为前区、中区和后区３个部分，其合成分泌的丝胶蛋白占蚕丝蛋白总量的２０～２５％；家蚕后部丝腺是合成和分泌占蚕丝总量７５％～８０％的丝心蛋白的器官。

家蚕丝腺起源于外胚层，在胚胎发育的第１７～１８期两侧体节出现丝腺基板，
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期性地干扰１３折叠层结构，这可能就是丝纤维有弹性的原因。

实际上，不同品种蚕丝产生不同量的这种非折叠层结构，因而弹性也有差别。

丝心蛋白是提供蚕茧的强韧又有弹性的优质蛋白质纤维。

３．１丝心蛋白重链
丝心蛋白是蚕丝的主要成分，约占蚕丝（茧丝）的７５～８０％。

丝，Ｉｆ，蛋白主要由丝心蛋白重链Ｈ链（ｆｌｂｍｉｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎ，ｆｌｂ－Ｈ）、轻链Ｌ链（ｆｉｂｒｏｉｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ，ｆ．ｂ．Ｌ）及糖蛋白Ｐ２５（Ｆｉｂｒｏｈｅｘａｍｅｄｎ）组成，以下主要介绍各自的结构特征以及它们如何组成丝心蛋白基本单位（ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙｕｎｉｔ）。

丝心蛋白Ｈ链基因在蚕基因组中是单拷贝的。

它由２个外显子（ｅｘｏｎ）和一个内含子（ｉｎｔｒｏｎ）构成。

外显子ｅ１长６７ｂｐ（其中＋１～＋２５位为非翻译序列，＋２６～＋６７位为１４个信号肽氨基酸编码区），起始位点＋１。

内含子９７１ｂｐ（＋６８～＋１，０３８）。

外显子ｅ２长１５，７５０ｂｐ（＋１，０３９～＋１６，７８８）。

终止密码弘Ａ。

图１．３家蚕丝心蛋白重链重复区的构成（Ｚｈｏｕ，Ｃ．２０００）Ｆｉｇ。

１．３ＦｉｎｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｄｏｍａｉｎｓｏｆＢｏｍｂｙｘｍｏｒ／Ｆｉｂｒｏｉｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎ
Ｈ链基因编码区域全长１５．７９２ｂｐ，为大约５，２６３个氨基酸编码，蛋白质分子量３９１，３６７ｋＤ。

１～１５１位氨基酸为Ｎ端非重复区域，其余Ｈ链核心区域“１，４４９～＋１６，６１１位）由１２个重复区段（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｄｏｍａｉｎ，Ｒ０１～Ｒ１２）和１１个中介序列（无定形区域，ａｍｏｒｐｈｏｕｓｄｏｍａｉｎ，Ａ０１～Ａ１１）相间排列构成，ＧＣ含量约６３％。

终止密码上游约１，９００ｂｐ～４００ｂｐ区段在不同的蚕品种间有差异，可能是多态性表现。

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中国科学技术大学硕士论文第二章
本实验着重关心在５龄期丝腺特异表达的基因，即在５龄期中部丝腺和后部丝腺表达克隆数的总和大于所有文库表达量平均值２倍以上的目的基因（数据来自日本的ＳｉｌｋＢａｓｅ项目和中国的ＳｉｌｋＤＢ项目）。

同时将这些目的基因按照各自的代谢途径和信号级联反应归类分析，讨论这些途径与丝线的合成、包装、分泌可能的作用方式。

３．２家蚕丝腺表达谱的特点
在分析比较中部丝腺和后部丝腺的表达差异时，我们发现后部丝腺表达的基因种类明显少于中部丝腺表达的基因的种类，大多数后部丝腺表达的基因集中在与丝心蛋白合成和转运相关的途径，而且大多数的同一基因在后部丝腺所表达的丰度要明显高于中部丝腺的表达量。

这在一定程度上说明，后部丝腺是为了分泌占蚕丝蛋白７５％以上的丝心蛋白，相对于中部丝腺进一步在功能上发生了相应的特化。

图２．１家蚕中部丝腺和后部丝腺基因表达丰度及功能分组的对比我们将中部丝腺和后部丝腺表达的基因按功能分组，并比较各组表达丰度。

表达数据来自于日本ＳｉｌｋＢａｓｅ研究项目的５龄期中部丝腺和后部丝腺的ＥＳＴ文库（分别由６５０条和７２９条克隆构成）
Ｆｉｇ．１．ＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｒｏｕｐａｂｕｎｄａｎｃｅｓｏｆｇｅｎｅｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎＭＳＧａｎｄＰＳＧ．Ｗｅｃｌａｓｓｉｆｙｔｈｅｓｅｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｏｓｅｖｅｒａｌｇｒｏｕｐｓａｎｄｄｅｐｉｃｔｔｈｅｉｒ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
由６５０和７２９克隆组成），表达丰度最高的是蛋白合成装置（ｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｍａｃｈｉｎｅｒｙ）。

其中核蓿体蛋白（ｒｉｂｏｓｏｍｅｐｒｏｔｅｉｎｓ）的表达数为后部丝腺文库的３８．７６％（２０２条克隆），而只占中部丝腺的１４．１５％（９２条克隆）；然而翻译因子（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ）的表达丰度则在两个文库比较接近。

在后部丝腺和中部丝腺分别为５．４９％（４０克隆）和５．３８％（３５克隆）．因此在后部丝腺，蛋白质合成对翻译因子的利用效率要更高一些。

此外，我们还发现一些氨基酸合成途径，尤其是丝氨酸合成途径的酶类，在中部丝腺和后部丝腺表达的差异较大，分别为１．０８％（７个克隆）和３．５７％（２６个克隆）。

这些数据也在一定程度上间接证实了家蚕后部丝腺的甘氨酸和丝氨酸间可以积极的合成和代谢，而不是仅仅依赖于血淋巴的供给。

我们从挑选了有丝分裂相关的信号蛋白和细胞自噬蛋白，分别设计特异性引物和简并性引物，利用ＲＴ－ＰＣＲ来检测在丝腺体内的表达情况。

考虑到不同表达丰度的转录本可能对不同检测方法的灵敏度不同，我们同时也选取一些在之前ＥＳＴ文库构建没有检测到表达的，但是丝腺应该表达的管家基因来试图说明这些检测表达技术，包括ＥＳＴ都是有其局限性的。

下图是我们检测后期促进复合物（ａｎａｐｈａｓｅ—ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ，ＡＰＣ）。

ＡＴＧ４和一些氨酰．转运核糖核酸（ｔＲＮＡ）合成酶在丝腺的表达。