植物组织可溶性蛋白质的测定-考马斯亮蓝G-250法
更新时间2015-5-19
1、目的:测定植物组织的可溶性蛋白含量,测定范围为100-1000ug/ml,高浓度需要稀释后测定。
小分子蛋白和肽的测定需要用福林酚试剂。
2、提取:用测定SOD (0.05M pH7.8磷酸缓冲液)或者POD (0.1 mol / L 磷酸缓冲液 (pH6.0)的提取液或者用水提取均可,但混匀后要放置0.5-1小时再离心,以充分提取。
单独测定时,取样品5g,加水50ml,破碎,冷藏存储,测前10000rpm离心10分钟备用,取样0.1-0.2ml测定(如果加水比较少,计算时应考虑材料水分)。
3、测定:以提取液为对照,以牛血清标准蛋白为标准,以考马斯亮蓝G-250为显色剂,显色2-30分钟内,在595nm 比色。
4、计算:
可溶性蛋白含量(ug/g鲜重)=测定含量(ug)*总提取体积ml/取样体积ml/鲜重g。
5、试剂配制:
5.1、牛血清白蛋白标准溶液的配制:准确称取0.100g牛血清白蛋白,溶于100mL蒸馏水中,即为1000μg/mL的原液,此液不用时应冷藏保存,可用15天。
将1000μg/mL牛血清白蛋白用提取液稀释10倍,作为工作液,浓度为100μg/mL。
5.2、考马斯亮蓝G-250蛋白显色剂:称取0.050g考马斯亮蓝G-250,溶于25mL95%乙醇中,加入85%(W/V)的磷酸50mL,最后用蒸馏水定容到500mL。
此溶液在常温下可放置1个月。
标准曲线及样品配制表 蛋白含量(μg) 100μg/ml标准蛋白(μl) 提取液 (μl) 考马斯亮蓝G-250显色剂 (ml)
0 0 1000
2.5 20 200 800
40 400 600 60 600 400 80 800 200
100 1000 0
样品* X(一般叶片为1000) 1000-x
*注1:样品量依据显色调整,生长旺盛期小麦叶片可溶性蛋白含量一般为1mg/g数量级。
注2:比色需用玻璃比色杯,不能用石英比色杯,因石英吸附颜色,影响测定。
注3:最好首先让比色杯吸附颜色,再测定标准样品和未知样品,可消除部分误差。
注4:因染料吸附特性决定,本曲线非直线,不要用直线模式(4次拟合较好) 注5:缓冲液对显色强度影响较大,需要使标准曲线和样品保持相同的缓冲液浓度。
注6:如果配制的考马斯亮蓝G250有沉淀,可过滤后使用,在排除其他试剂形成沉淀后,表明G250已经过期,下次不能再用。
注7:此方法消光值随时间变化巨大,最好随加染色液随测定。