清脂益肝汤对非酒精性脂肪肝大鼠治疗
的实验研究
1．2．1 动物分组与模型建立：43只大鼠在动物房内适应性喂养1周后，随机分为4组：正常对照组(I组)10只，模型组(1I 组)l1只，清脂益肝汤组(Ⅲ组)11只、二甲双胍组(Ⅳ组)11只。
Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组饲以高脂饲料，配方为：普通饲料+1％胆固醇+ 14％猪油，由天津市华容实验动物中心饲料厂配制；正常对照组饲以普通饲料，实验动物自由饮水和进食。
4周后随机抽取Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ三组中各一只大鼠脱颈处死，病理证实脂肪肝已形成。
清脂益肝汤组给生药16 g·ks ·d～，灌胃治疗；二甲双胍组给170 mg·ks～·d (按成人剂量1．5 g／d折算)溶于5 rnl蒸馏水中
灌胃。
正常对照组、模型组给予同量蒸馏水灌胃，各组按原饲料进行饲养。
8周后，全部脱颈处死，取血及肝组织待测。
1．2．2 观察指标及检测方法：(1)观察大鼠食欲、体重、毛发及死亡情况。
(2)血清指标测定：测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、
天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)、
空腹血糖(FBS)、游离脂肪酸(FFA)；放免法测定空腹胰岛素(FINS)。
胰岛素抵抗指数计算：胰岛素抵抗指数(HOME-IR)：
(~33s×F~NS)／22．50。
(3)取肝组织一块马上置于液氮中用RTPCR 法检测肝组织中瘦素mRNA(1eptin mRNA)的表达。
1．3 组织病理学标本的制备取肝左叶用10％甲醛溶液固
定，石蜡包埋，HE染色，光镜下观察组织学改变。
2、化痰泄浊方对脂肪肝模型大鼠胰岛素抵抗及瘦素
的影响
1．2．1 分组与模型制作 SD大鼠48只，常规饲养1周后随机分为5组：正常对照组、模型组、DBGTT组、HTXZR高剂量和低剂量组，其中正常对照组8只，其余4组各1O只。
正常对照组予以基础饲料喂养，其余4组均以高脂饲料(84 9／6基础饲料+1o猪油+5 蛋黄粉+1 胆固醇)喂养，并于造模第1天予以腹腔注射四环素150 mg／kg，后每隔6 d腹腔注射四环素110 mg／kg 1次，共6次。
1．2．2 给药方法自造模第1天起，除正常对照组外，其余各组均按5 ml〃kg 〃d一，1次／d，分别灌服生理盐水或相应的药物溶液。
HTXZR高剂量和低剂量组的给药浓度分别为HTXZR 2 g／ml和1 g／ml(相当于成人用药剂量的2O倍和1O倍)；DBGTT溶于蒸馏水中，制成浓度为0．06 g／ml的溶液，给药浓度为0．225 g〃kg。
〃d (相当于成人用药剂量的1O倍)。
连续7周。
4种中药复方对大鼠脂肪肝模型胰岛素抵抗及瘦素的影响
1．2．1 分组与模型制备：SD雄性大鼠，1 10只，随机分为空白组、模型组、东宝肝泰组(东宝组)、
化痰祛浊高剂量组(化痰高组)、化痰祛浊低剂量组(化痰低组)、疏肝健脾高剂量组(疏肝高组)、疏肝
健脾低剂量组(疏肝低组)、凉血活血高剂量组(凉血高组)、凉血活血低剂量组(凉血低组)、滋阴补肾
高剂量组(补肾高组)、滋阴补肾低剂量组(补肾低组)等
1 1组各10只；常规饲养1周后，除空白组给予基础饲料外，其余10组均饲以高脂饲料(质量分数84％
基础饲料+质量分数10％猪油+质量分数5％蛋黄粉+质量分数1％胆固醇)，并于造模第1 d腹腔注射
四环素150 mg／kg，其后每6 d 1次腹腔注射四环素1O0 mg／kg，计6次。
1．2．2 给药方法：自造模第1 d起，除空白组外，各组分别灌服生理盐水及相应药物，东宝肝泰溶
于蒸馏水中，制成0．06 g／ml的混悬液，灌服剂量为0．225 g／(kg·d)，相当于成人用药量的10倍。
高剂量组按10 ml／(kg·d)灌胃，相当于成人用药量的20倍，低剂量组按5 ml／(kg·d)灌胃，相当于成人用药量的10倍。
1．2．3 标本采取：于造模第7周结束时采集标本。
方法：隔夜禁食，次日以20 g／L戊巴妥钠溶液1 ml ／kg腹腔内注射麻醉后，从腔静脉采血，然后迅速取出肝脏称肝湿重，计算肝湿重／体重比值，即为肝指数。
所采血在30 min内离心取血清待检。
1．2．4 指标测定：瘦素及空腹胰岛素定量采用放1．6 标本采取于实验造模第7周结束时处死各组动物，方法：隔夜禁食，次日以2％戊巴妥钠溶液1ml／kg体重腹腔内注射麻醉后，迅速取出肝脏称肝湿重，并取肝左叶0．1cm x 0．1cm x 0．6cm 标本2～4块经戊二醛锇酸固定、然后取同部位肝左叶1块0．5cmX 1cm X 0．3cm 组织置于l0％磷酸缓冲甲醛液
固定。
1．7 指标涸定
1．7．1 瘦素及空腹胰岛素定量采用放射免疫方法，
单位以 g／ml表示。
根据_5】推荐公式计算胰岛素抵抗
指数(胰岛素抵抗指数=空腹血糖含量X空腹胰岛
素含量／22．5)。
1．7．2 肝脏病理光镜：取肝左叶，中性甲醛固定肝标本，肝组织石蜡切片HE染色观察肝脏病理学改变。
电镜：标本经戊二醛锇酸固定，环氧树脂包埋，超薄切片透射电镜观察肝组织超微结构变化。
光镜下评估肝脂肪变性程度，判断标准按照脂变细胞占肝细胞的百分比进行脂变程度分级_5】。
三七总皂苷对大鼠非酒精性脂肪肝模型
胰岛素抵抗及瘦素受体表达的影响
1．1 实验动物及饲料选取Wi~ar雄性大鼠40只(由山西医
科大学实验动物中心提供)，体重(180±20)g，实验室温度
(18-22)℃，湿度45％～65％，各组动物单笼喂养，自由饮水。
基础饲料(山西医科大学实验动物中心提供)；高脂饲料：基础饲
料84．5％、蛋黄粉10％、猪油5％，猪胆盐0．5％。
1．2 试验用药品及试剂三七总皂苷粉剂(云南玉溪市维和制1．4 动物模型分组及标本制备适应性饲养7 d后，按体重编
号，完全随机分组，正常组10只、造模组30只，均自由进食、进水。
正常组喂养基础饲料，造模组喂养高脂饲料。
3个月后随
机解剖正常组大鼠2只和造模组大鼠6只，取肝组织，HE染色。
造模成功后，造模组停喂高脂饲料，改为普通饲料喂养，剩余32 只大鼠再随机分为4组，每组8只。
正常组：纯净水4 mL／d灌
胃30 d；模型组：纯净水4 mL／d灌胃30 d；三七总皂苷低剂量组：三七总皂苷100 mg／(kg·d)灌胃30 d；三七总皂苷高剂量组：三七总皂苷200 mg／(kg·d)灌胃30 d。
各组大鼠药物干预
30 d后，禁食、禁水12 h，次日称体重，注射25％乌拉坦0，4 mL／kg，
麻醉后腹主动脉取血每只4 mL，室温下2 000 r／min离心15
mln，分离血清，一40℃冰箱保存。
迅速取出肝脏，称湿重，并取肝右叶2块用10％甲醛固定，分别用于HE 染色和瘦素受体免
疫组化染色。
1．5 指标测定
1．5．1 血清瘦素及空腹胰岛素采用放射免疫法，计算胰岛素抵抗指数(胰岛素抵抗指数=空腹血糖含量×空腹胰岛素含量／22．5)。
1．5．2 普通病理学检测10％甲醛固定，石蜡包埋，组织切片，HE 染色，光镜下观察普通病理学变化。
光镜下评估肝脂肪变
性程度，判断标准按照脂变细胞占肝细胞的百分比进行脂变程度分级 J。
1．5．3 免疫组化染色采用SABC法。
方法为切片脱蜡；3％
H202溶液处理；热修复抗原；5％BSA封闭；滴加大鼠瘦素受体单克隆抗体一抗(浓度1：100)，4℃冰箱过夜；隔夜滴加生物素化养抗兔Iga二抗，37℃孵育20 min，再滴加试剂SABC；DAB
显色；苏木精复染。
细胞呈棕黄色为阳性，蓝色为阴性。
1．5．4 病理指标分析对各组免疫组化染色最显著区域的表
达进行图像分析，在400倍光镜下测量每个显示屏的染色强度(平均光密度)。
每张切片选取染色最显著的6个视野，分别测
量光密度，然后计算其平均值，来说明各组瘦素受体的表达情况。
1．6 统计学处理使用SPSS 13．0统计软件进行统计学处理。
计量资料以均数±标准差(i±S)表示。
多组间比较采用方差
分析和两两比较的SNK—q检验、Pearson相。