细胞电转染电转的简介 (1)电穿孔转染的基本原理及过程 (1)电穿孔转染条件的选择 (1)1 电参数 (1)2脉冲时程 (2)3 脉冲次数 (2)4 细胞因素 (3)5 质粒因素 (3)6 温度 (4)7．缓冲液以及培养液的成 (4)仪器常用键区介绍 (5)Neon TM电转染一般流程 (7)电转的简介电穿孔转染，作为物理方法的一种，出现于20世纪80年代中。

这种方法不仅能够将DNA、RNA，还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。

它是一种高效、简便的基因转移系统，具有其它转移方法无可比拟的优越性，如操作简便、快捷，可重复性强，臻染率高，适用谱广等。

尤其对目前一般认为难转染的悬浮培养细胞也能获得较高的转染。

电穿孔转染的基本原理及过程电穿孔法是通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后，在细胞膜上暂时形成小孔或开口，把大分子如DNA等导入细胞并最终进入胞核的技术。

其过程简述如下：首先在电击过程中，细胞膜上出现穿孔，质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触，并与细胞膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。

再次电击后，质粒脱离复合物并扩散至胞质内，开始瞬转；同时小部分质粒进入核内与染色体整合，开始稳转。

一旦DNA扩散进入细胞，细胞膜上的小孔可自动重新闭合。

电穿孔转染条件的选择1 电参数电场强度E与电压V有以下关系：V=E×d，在电穿孔实验中，d为两电极之间的距离，是一个定值，故本文所指的电场强度的选择即电压的选择。

对于动物细胞来说，电场强度通常选择1～1000V／cm，并遵循低电场长时程的原则。

电场强度的大小对DNA摄入量的影响主要有：在阈电场强度Ec (Ec=Uc／1．5R)以下无R)以下无DNA摄入；适中的场强下DNA的摄入呈电场依赖型，随场强的升高而增大；高场强下，DNA的摄入进入平台期，与电场的大小无关。

电场强度的大小对细胞存活率的影响主要有：在阈电场强度以下存活率无变化；在适中的场强下，存活率呈电场依赖型，随场强的升高而下降；存活率在高场强下降为0。

因此，要保证较高的转染效率，必须综合考虑DNA摄入量以及存活率两个方面。

不同的细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方式除了实验直接测定比较不同场强下(对悬浮细胞来说，取1～3倍的阈电场强度，对贴壁细胞来说可升至5倍)转染率的高低之外，还可以采取较为简便的间接法。

文献显示存活率在50％左右的电场参数为较理想的参数，故可间接测定存活率来确定最佳场强值。

2脉冲时程时间常数为电容与电阻的乘积，是设定的电压呈指数衰减到37％的时间。

电脉冲的时间长短对电转染效率有较大的影响，太长、太短都会使转染效率下降。

最佳时间的确定主要取决于细胞的大小，细胞越大，穿透胞膜所需的脉冲时程越长。

电转染真核细胞的脉冲时程一般控制在ms级(不小于1 ms)。

电脉冲之前，DNA和细胞随机分布于电极之间；电脉冲早期，DNA和细胞向阳极运动；电脉冲后期DNA分子撞向细胞阴极面或末端，并且插入细胞外膜或者进一步进入细胞膜间隙，随后在孵育期间，DNA通过内膜渗透进入胞质。

因此电压脉冲有双重效应，即驱使DNA快速向阳极运动以及向受体细胞表面渗透。

电脉冲的时间太短，则不能使DNA分子有效进入细胞；而电脉冲时间过长，细胞局部过热可导致不可恢复的损伤，同时电泳所引起的细胞内外的物质进出(如Na+／K+浓度差的破坏)都可引起细胞存活率下降，转染效率的提高被抵消。

真核细胞基因转染一般遵循低电场长时程的原则。

长时程(一般20～60 ms)可使细胞上的穿孔更大，开放时间更长。

此外，适当地延长时程也能降低电穿孔的阈电场值，加大电场依赖性吸收的斜率，提高平台期电场值的放大作用。

3 脉冲次数脉冲次数的选择一般为1～10次，实验证明对于大多数细胞系较理想的脉冲次数为3～4次。

第1次脉冲后，外加的电场开始在细胞膜上穿孔，第2 次脉冲后，DNA在电泳力以及细胞膜蛋白运输的共同作用下转入细胞，当然脉冲也同样触发电渗透、扩散、内吞等运输方式。

理论上，2次脉冲足以使DNA转入绝大多数细胞，再增加脉冲次数，虽仍有助于提高转染效率，但如果次数多于5次，导致细胞损伤直至死亡的负面效应便抵消了对转染效率的提升。

两次脉冲之间一般有1 min的间隔时间(稍长也不影响结果)，在这段时间内，电穿孔的细胞可再生一些必需的细胞膜成分，以恢复部分功能，同时，细胞在这段恢复时期发生旋转(Brownian运动)，基本解除胞膜的同一位置被多次电击的危险。

4 细胞因素用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内，传代后2 d)。

因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构致密度比稳定期的细胞差，电转后，细胞膜的恢复能力强，而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源的DNA。

因此，处于对数期的细胞转染率和存活率都比衰老的细胞好。

当细胞生长到A600为0.72～0.78时，可获得更高的转染效率，故收集细胞的时间十分重要。

细胞悬液的密度一般为1×106／ml，当细胞生长密度>3×106／ml(A600>O．85)时，转染效率会骤然下降。

原因除了细胞老化之外，细胞过密会使相邻细胞相互作用增大，甚至使细胞相互融合，从而导致电场的局部微扰，使电场环境无法均一化。

细胞体积越大对电击越敏感，所需的电场强度也就越小。

5 质粒因素从质粒的浓度看，细胞密度为1×106／ml时，DNA用量在2～5ug／ml转染效率最高。

转染率在一定范围内随质粒浓度的上升呈线性增高，但到达一个峰值后，随DNA用量增加而转染率逐渐下降。

其原因可能为细胞吸纳DNA有一个饱和度，过量便会产生毒性，使存活率降低，不利于转染率的提高。

从质粒的大小、构象、序列看，一般说来，转染效率随着质粒的碱基对数的增多而上升，同时，线状的DNA比环状DNA的转染效率更高，而且更容易进入核内整合到染色体上，得到稳定表达。

所以在电转前一般选择合适的限制性内切酶，将质粒线性化，以期得到较高的转染效率。

此外，如CMV、SV40等病毒启动子有助于基因在真核细胞内的高效表达。

从质粒的纯度看，用高纯度的DNA才能提高电转的效率，且应注意以下几点：首先DNA／RNA应该超纯(A260／A280>1．8)，其次应不含内毒素，同时质粒应溶于双蒸水而不是TE缓冲溶液，因为当DNA样品中存在EDTA或缓冲盐类(如Tri时，转染效率会急剧下降。

6 温度一般情况下，电转的过程是在室温下进行，但在电击前后可对细胞进行冰浴处理。

电击前冰浴的时间对转染率影响不大，但低温环境能够防止DNA被外源性DNA酶降解，并限制在电击中因Joule作用而产生的不良反应，因此，实验一般选择电击前冰浴5min。

电击后冰浴，会影响DNA摄入，因为电击后冰浴可增强细胞收缩，细胞膜上的电穿孔封闭较慢，延长外源性DNA摄入时间，从而提高其摄入量。

在室温环境下，虽然细胞膜上的孔封闭速度快，但在随后2h，质粒还可通过电内化进入细胞，因此摄人量不一定比4℃环境下低。

而且，室温下细胞在5 min内即闭孔，在4℃的环境下穿孔状态可保持4h，穿孔封闭缓慢降低了存活率，同时细胞在低温下更容易受到损伤，因此，综合考虑摄人量和存活率，大部分文献倾向于电击后细胞仍在室温或37℃下保存。

7．缓冲液以及培养液的成①电转前培养液的选择：真核细胞常用RPMI 1640+10％FCS(胎牛血清)培养。

②电转培养液选择：细胞受电击后产生孔洞使细胞质与电转缓冲液直接接触，因此细胞对渗透压和缓冲液离子组成十分敏感。

从渗透压来说，低渗缓冲液比等渗或高渗缓冲液更利于获得较高转染率，因为低渗的环境可降低电导并限制Joule作用，利于质粒的转染。

对于不同的细胞系也可将等渗和低渗的缓冲液按不同的比例混合使用。

最佳的混合物是使细胞在达到最大程度肿胀(达到最大细胞直径)的同时，细胞裂解死亡率又小于10％。

从组成来说，常用的电转缓冲液分3类：第1类为细胞培养液，如RPMI 1640，DMEM，DMEM／F12等；第2类为磷酸缓冲液，如K—PBS，HBS，HeBs，PBS等；第3类为Cytomix缓冲液，Cytomix配方如下：120 mmol／L KCI，0.15 mmol／L CaCl2，10 mmol／L K2HP04(pH=7．6)，25 mmol／L HEPES(pH=7．6)，2 mmol／L EGTA (pH=7．6)，5 mmol／L MgCl2，2 mmol／L ATP，5 mmol／L谷胱苷肽。

相比之下，Cytomix 的转染率最高，特别是对难以转染的半贴壁细胞和悬浮细胞，而且死亡率较低。

Cytomix缓冲液组成与细胞内离子成份非常相似。

有助于细胞保持其通透性。

与常用的电转缓冲液PBS和完全培养液相比，Cytomix缓冲液中Ca2+、M92+、Na+浓度低，用EGTA 代替EDTA，pH值、K+浓度高。

该缓冲液最大程度上模拟了真核细胞内离子环境，同时Cytomix中的ATP和谷氨酰胺可阻止细胞质成分渗漏，加强细胞膜抗氧化作用，有利于电穿孔的重新闭合凹。

③电转后培养液的选择：细胞在电击后十分脆弱，其培养液的选择应注重提高细胞的存活率，一般选择低渗的RPMI 1640+10％FCS。

除此之外，可参考加入50 mmol／L海藻糖+1.25％DMSO，因为海藻糖具有稳定DNA、蛋白质以及细胞膜的作用，并提高电转后细胞特别是淋巴细胞的存活率。

此外，有文献显示凋亡是细胞电击后死亡的主要原因，电击后的培养液还可加入Caspase抑制剂和SCF、GM-CSF等细胞因子。

仪器常用键区介绍Neon TM电转染一般流程1．电穿孔前一至两天，将细胞转移至装有新鲜培养基的培养皿中，保证实验当天细胞量达到70-90%。

2．加培养基（不含抗生素）到24孔板中，每孔500µl，放于37℃培养箱预热。

（注：使用其他孔数培养板或者100µl枪头时，加入培养基和质粒及细胞的数量见下表1）3．将培养细胞取出，悬浮细胞直接取部分培养的细胞计数，确定细胞密度；贴壁细胞用2ml 的PBS冲洗细胞，吸出PBS，加入约750µl胰酶消化3min，加入750µl培养基，终止消化，取部分细胞悬液进行细胞计数，确定细胞密度。

4．将悬浮细胞转到离心管，室温下100-400g离心力离心5min，倒掉上清。

5．向细胞中加入2ml PBS冲洗细胞，室温下100-400g离心力离心5min。

6．吸出PBS,用重悬缓冲液R重新悬浮细胞沉淀，最终使细胞密度为2.0×107个/ml。

轻轻吹打细胞，使其形成单细胞悬液。

（注：细胞悬液在室温时间不能超过15-30min,否则将导致细胞活性和转染效率降低）7．将适量质粒加到1.5ml离心管中，再加入细胞悬液，轻轻混匀。