乙烯信号转导通路中核内转录因子 在盐胁迫条件下表达变化的研究
石英1 (中国农业大学食品科学与营养工程学院,100083)
摘 要 :本试验以萌发 12
24 48hr 时番茄幼苗为试验材料研究了盐胁迫条件下, 乙烯信号 转导通路中核内转录因子的表达变化, 试验表明盐胁迫可以诱发番茄幼苗对逆境的适应性反 应, 胁迫和植物体内生长因子均可以影响核内转录因子的转录水平的变化, 同时试验表明乙烯 信号通路中的核内转录因子 Le-EILs 和 Le-ERFs 有可能处于不同信号通路的结点上. 关键词:转录因子, 盐胁迫, 三重反应
Abstract: Treating the tomato seedling with different salt stress, the tomato seedling exhibited
with exaggerated triple response in order to adjust with environment stress. The result of the experiment suggested that the transcription factors expression of ethylene signal transduction pathway could be induced by stress and growth factor. So we can consulted that the LeEIL1-3 and LeERFs play role in different signal transduction pathway Key word: transcription factors , salt stress, triple response
B
7: 0.08M 12hr 8:0.16M 24hr 10:0.04M48hr 11: 0.08M 48hr 12:0.16M48hr
C
D 1 2 图三 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
ERFs 在幼苗盐胁迫下的表达变化
3.3.2 Le -ERFs 的表达情况. 3.3.2.1 Le-ERF1 的表达变化 在处理 12hr 时 见图三 A , 适度胁迫诱导该基因的表达,LeERF1 的表达随胁迫浓度增高, 表达减弱, 至 0.16M 时表达低于对照, 几乎消失, 而此浓度在处理幼苗 24hr 时与 0.04M 0.08M 一样, 表达量几乎与对照持平, 不同胁迫程度几乎不影响基因的表达水平, 处理 48hr 后,0.16M 的处理水平抑制 Le-ERF1 的表达,0.04M 0.08M 的 NaCL 处理对基因的表达不构成影响. 3.3.2.2 Le-ERF2 的表变化 胁迫可以诱导幼苗生长初期 Le-ERF2 的表达 见图三 B , 但是 0.08M 的 NaCL 处理 12hr 和 0.16M 48h 的处理减弱了 Le-ERF2 的表达 在其他处理浓度和时间上没有表现基因 表 达量上的差异 3.3.2.3 Pti4 的表达变化
4
在幼苗生长初期, 无论胁迫与否,Pti4 几乎均不表达 见图三 C , 处理 24hr 后, 胁迫诱导 Pti4 基因的低水平表达, 并且这种诱导随浓度的增加而增加. 处理 48hr 后, 随胁迫浓度的增高, 基因表达量降低.
4. 讨论
4.1 黄化幼苗的三重反应是乙烯生理作用无可置疑的重要标志(Wang K.L 2002),在本试验中 采用不同浓度的盐溶液处理番茄幼苗, 经处理后的番茄幼苗乙烯释放量增加并表现出典型的 三重反应的表现型. 说明由胁迫导致的番茄幼苗的乙烯释放量增加进而导致的三重反应的发 生, 是植物本身对于外界环境胁迫的适应性反应. 4.2.从乙烯信号转导通路中核内转录因子在不同盐胁迫程度中表达变化表明, 在本试验中所 涉及到的六个核内转录因子均响应于外界环境的盐胁迫因子, 虽然胁迫诱导的转录表达并未 表现出与胁迫程度的线性相关, 但至少表明盐胁迫因子是调控乙烯信号转导通路的核内转录 的因子之一. 4.3.对番茄种子萌发后的幼苗分别在 12hr 24hr 48hr 的三个生长阶段的乙烯信号转导通 路的核内转录因子的表达变化的研究表明 除环境中的胁迫因子影响其转录水平 植物体内 的生长因子也对核内基因的表达产生深刻的影响 虽然本试验并未涉及到直接调控 Le-EILs 的上游调控基因和被 Le-ERFs 直接调控的下游基因 但是试验表明胁迫因子和生长因子均 可以调控乙烯信号转导通路中的核内转录因子的表达 我们有理由认为本试验涉及的六个转 录因子有可能处在多种信号通路的结点上 4.4.乙烯在种子萌发过程中起很重要的作用, 以往资料表明 颜季琼等 1984 种子萌发过程 中, 乙烯的释放高峰出现时间, 在不同的植物种类之间有所不同 萌发的种子通常在萌发的第 一 燕麦 或第二 苍耳 莴苣 天达到乙烯生成的最高值随后下降 本试验采用的番茄种 子萌发过程中的乙烯释放高峰约出现在萌发的第一天并且随后下降 胁迫处理可以增加不同 生长期的番茄幼苗乙烯的释放量 但是并改变种子萌发后乙烯释放量降低的趋势
C
D 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
图二 Le-EILs 在盐胁迫下的表达变化
注
A:Le-ERF1 B:Le-ERF2 C:Pti4 D:rRNA 2:0.04M 12hr 4:0.16M12hr 6: 0.04M 24hr
A
1:CK 12hr 3:0.08M12hr 5:CK 24hr 9:CK 48hr:
2 试验材料和方法
2.1 试验材料 以加工番茄 Lycopersicon esculentum UC-82 为试验材料 种子浸种催芽后 挑选露白的种子播种于含不同处理液的 50ml 三角瓶中 支持基质为珍珠岩 2.2 试验方法 2.2.1 试验处理 : 以 蒸 馏 水 为 对 照 CK 以 NaCL 为 胁 迫 条 件 种子分别播种于含 NaCL:0.04M 0.08M 0.16M 处理液中 处理 12hr 24hr 48hr 测定密闭 12hr 的乙烯释放 量 处理后的试验材料用蒸馏水清洗后立即用液氮冷冻 -70 保存 用于总 RNA 提取 2.2.2 杂交探针 :选取番茄中 EIN3/EIL 家族的 Le-EIL1 Le-EIL2 Le-EIL3 LeERF 家族中 的 LeERF1 LeERF2 Pti4 为 Northern Blotting 的探针 研究乙烯信号转导通路中的核内转 录因子在盐胁迫下的表达, 以上探针均为本实验室保存 2.2.3 RNA 的提取 参见徐晶宇论文 2.2.4 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 杂交 参见徐晶宇论文 2.2.5 乙烯的测定 采用惠普 GC-6890 型气相色谱仪测定乙烯 HP-5 毛细管柱 柱长 30.0m 直径 320um 氢火焰离子探测器检验 载气 N2 燃气 H2 流量 30ml/m 柱温 80 检测器温度 160 进样口温度 １２０
1 引言
植物生长的环境变化多端 各种各样的环境条件都会影响植物的生长和发育 为了适应 复杂多变的环境 植物在长期的进化过程中 形成一套使其本身能够应付各种环境的独特的 基因表达调控系统 在不同的生物和非生物胁迫下会诱导包括编码病程相关蛋白以及抗真菌 蛋白的基因表达 这些生物和非生物逆境包括病菌侵染 伤 光辐射 温度 干旱等 而且 植物激素乙烯处理亦可诱导以上基因的表达 Ecker 1995 O Donnell 等 1996 O Donnell 等 1998 Penninckx 等 1996 Penninckx 等 1998 胁迫处理也可促进乙烯的生物合成 Ecker 1995 O Donnell 等 1996 因此乙烯被认为能够介导逆境胁迫反应的媒介 尽管乙烯的结构极为简单 但却是调节植物生长发育的极具潜力的调控因子 Ecker 1995 乙烯的生物合成受其内部生长发育因子和外界环境条件的严格控制 因而乙烯的生 物合成和乙烯的信号转导的研究成为人们知晓乙烯在植物生长发育中所起作用的焦点问题 乙烯的生物合成途径于上世纪 70 年代末由杨祥发等人进行了清晰的阐述 进而乙烯的信号 转导成为近年来乙烯研究中的热点 利用拟南芥黄化幼苗对乙烯反应的突变体 在基因水平 上进行上位性分析 人们得到了乙烯信号转导的框架模型 即由 C2 H4 ETR CTR EIN2 EIN3 ERF 乙烯反应 Ecker1995 Chang 1996 Bleeker 2000 许多 乙烯反应包含了基因表达的变化 Wang 等 2002 EIN3 的克隆提供了早期乙烯信号转导通 路的核内调控的直接证据 Chao et al 1997 拟南芥中对 EIN3 的研究表明 EIN3 编码了一 类核定位的 DNA 结合蛋白 由多基因家族调控 其作用位点发生于 EIN2 的下游 Chao et al 1997 在拟南芥中的 EIN3 家族有六个成员 番茄中类似于 EIN3 的基因于 2001 年的得到 克隆 分别为 LeEIL1 LeEIN2 LeEIL3 Tiemet et al 2001 研究表明番茄中的 EIN3 家族 在功能上存在冗余性 Solano 等人的研究表明 在拟南芥中 EIN3 作用的直接靶基因是 ERF1 通过与 ERF1 基
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石英, 北京海淀区清华东路 中国农业大学食品科学与营养工程学院 (100083) 1
因启动子区的初级乙烯反应元件结合 从而激活此基因的表达 并且指出乙烯信号转导通路 在核内的信号传递包含有转录级联反应 乙烯反应元件结合因子 ERF 蛋白 即 EREBP 是植物特有的一类转录因子 其特点是具有高度保守的 被称为 ERF 区的 DNA 结合区 Fujimoto 等 2000 这一类基因成员众多其中包括烟草中的 ERFs 番茄中的 Pti4 Pti5 Pti6 以及 Le-ERF1 和 Le-ERF2 拟南芥中的 ERF1 等 此类基因最初的分离是基于其对 GCC-box 的结合能力 GCC-box 是一段 DNA 序列 位于乙烯和病害诱导表达相关基因的启 动子区 与这类基因表达关系密切 EIN3 是 ERF1 表达是充要条件 实验表明 ERF1 有可 能是调控 EIN3 下游的一个信号支路 除乙烯之外 SA JA 干旱等都可以诱导 ERF 的表 达 Wang 等 2002