小孢子梯度离心前后比较
梯度离心前 （小孢子形态、活力不一致）
30%蔗糖梯度离心后 （获得均一的小孢子群体）
• 花粉培养方式
1、平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。 2、液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以 利通气。 3、双层培养 花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养 基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面 加入少量液体培养基。 4、看护培养 利用花药或花药愈伤组织释放出的活性 物质促进花粉小孢子发育。 5、微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进 行花粉培养 6、条件培养基培养 利用培养过花药的液体培养基或含 失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房 条件培养等。
（4）培养条件 温度、光照、密度
4.检测方法
1、染色体直接计数法
通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。
2、间接鉴定
（1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪） （2）细胞形态学鉴定法 主要测定叶片单个细胞中DNA
的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。
叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫 细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。
培养基
三明市农科所生物技术中心以M8、 N6和NB培养基， 进行了不同水稻品种材料花培观察比较试验， 结果从出 愈率、 绿苗分化率两者比较， 还是M8 培养基较适合。 冯双华等用M8、 合5和改良M8做基本培养基， 以籼 型杂交稻两优培九、 培两优288、 P88S/0293为材料， 得 出改良M8培养基表现出对不同的基因型材料有较广的适 应性和较强的绿苗诱导作用。
（3）植株形态学鉴定法
粒小，不结实。
单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉
（4）杂交鉴定法 自交或测交鉴定，看后代分离情况 确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。 （5）分子标记鉴定 包括生化标记（如同工酶标记）
和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等）
三.研究意义
1.缩短育种周期：常规育种需4-6年获得纯系， 而花培仅需一年。
3.影响因素
（1）基因型
植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之 一。同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反 应差异较大。 如在水稻中，籼稻花粉培养力远低 于糯稻，且在同一亚种范围内，不同品种间也存在 很大差异。
（2）培养基和激素配比选择
应用于水稻花培的基本培养基种类较多， 如 N6、 马铃薯培养基、 L8、 SK3、 土豆培养基、 Miller、 合5、 通用、 LS、 White、 MS、 M8和改 良M8等。同一材料用不同的培养基培养， 表现出 不同的花培效果。
水稻花药培养由接种至长出愈伤图
• 花粉培养 与花药不同，花粉培养需进行花 粉的分离与纯化及特殊的花粉诱导培 养。
分离和纯化方法
1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法) 将花药接种 在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。 2、挤压法 在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培 养。 3、机械游离 （1）磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花 粉游离出来； （2）超速旋切法 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、 穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。 4、小孢子纯化 对上述方法获得的小孢子混合物进行分级 过筛、梯度离心处理纯化小孢子
激素配比
生长素类一般有2,4-D、 NAA、 IAA等， 细胞分裂 素一般有6-BA、 KT等。
使用倾向：复合激素
冯双华等提出籼型材料用1.5 mg/L 2,4-D+1.5 mg/LNAA诱导效果较好， 2.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+0.25 mg/L IAA分化效果较好。
▪截至目前，通过花培选育出了很多粳稻品种并大面积的 推广应用。1975-1998共审定26个品种。 ▪籼稻花药培养难度较大。至20世纪末，共有5个品种通过 花陪选育。
二 研究过程
• • • • 1.培养流程 2.培养方法 3.影响因素 4.检测方法
1.培养流程
花药和花粉培养基本流程：
选择合适的供体植株
郭书巧等提出对籼粳交材料2 mg/L 2,4-D+1 mg/L NAA+0.2 mg/L KT为最佳的激素诱导配比， 2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT分化效果较好。
结论：基因型不同，最适激素配比不同。一般认为， 对籼型水稻采用复合激素较好。
（3）田间取样与预处理
取样时间：晴天8:00~10:00， 或16:00~18:00 取穗标准：： 穗苞大而不破，剑叶与下一叶的 叶枕距为5~10 cm为宜 低温处理：一般认为5~8度条件下， 低温预处理 8~10d较好 此外，还有其它处理方法：化学物质、射线、离 心等。
预处理花药（物理或生理逆境）
收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子 培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体 胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株。
倍性鉴定或染色体加倍
2.培养方法
• 花药培养 1、取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适 宜的花蕾。 2、消毒 70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡 30-60s后在1％次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.1％ 的氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗3-5次。 3、培养 固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养， 至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面， 形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成 小植株。
水稻花药和花粉培养
2010.6.28

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目录
• 研究进展 • 研究过程 • 研究意义 • 前景展望
一 研究进展
1.水稻单倍体获得途径
花药培养、花粉培养 胚珠或子房培养（未受精）
概念：
单倍体育种：通过花药、花粉培养获得单倍体，然 后进行染色体加倍，经过选择、鉴定选育出新品种 的途径。 花药培养：是将花粉发育至一定阶段的花药接种到 人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织 进而分化成植株的技术。
花粉培养：是将花粉从花药中分离出来,接种到人 工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进 而分化成植株的过程。
水稻花培历史：
▪1968年，日本人新关和大野首次通过水稻花药培 养获得单倍体植株； ▪1970年，我国正式开展水稻花药培养技术研究， 并取得良好进展； ▪截至目前，已有多个品种通过花培途径获得。代 表成果：天津农科院选育的花育“花育1号”、“花 育2号”；中国农科院选育的中花系列；黑龙江农科 院水稻所选育的龙粳系列品种。
供体植株 小孢子（n）
花培 雄核发育 花粉植 株（n） 自然加倍 人工加倍 纯合植株DH （2n）
一年内获得纯系
2.提高了目标基因型的选择效率
例子： 二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为 AAbb的纯合单株 常规方法： AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与 Aabb、aAbb区分开。
AB AB aB Ab ab AABB aABB AabB aAbB aB AaBB aaBB AabB aabB Ab AABb aABb AAbb aAbb ab AaBb aaBb Aabb aabb
2.提高了目标基因型的选择效率
例子： 二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因 为AAbb的纯合单株 单倍体方法： AAbb出现的概率为1/4。
1999，美国洛克菲勒基金会的Toneeson在Science 撰文指出，现代生物技术育种的两大支柱是基因工程 育种和与分子标记相结合的加倍单倍体育种（DH育 种），后者效率高，成本低，特别适合于发展中国家 的国情。
3.有利于隐性基因控制性状的选择 4.与生物工程技术结合，对育种学及遗传基础研 究都有很重要的意义。
四.前景展望
1.供体植物生长条件的进一步提高和离体培ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ方法的 改进，有可能最终消除或大大减少花培药养基因型 的限制。 2.花药或小孢子培养体系做为基因转导的靶组织，可 以实现稳定的转化，外源基因在后代中不易丢失或 发生致命的突变，是很有前途的研究领域。
单倍体 供体亲本 AaBb 花培 二倍体
AB------ --------------------> AABB aB----------------------------> aaBB Ab----------------------------> AAbb ab-- --------------------------> aabb