家蚕生物反应器的研究进展及发展前景(1)摘要：目前,家蚕生物反应器的研究和开发主要是以BmNPV为载体,在家蚕体液中表达多种有用蛋白,其表达量比其它生化微生物高出许多倍;但是利用转基因家蚕生物反应器表达外源蛋白比家蚕BmNPV表达系统有着更大的优越性。
家蚕生物反应器研究和开发已近20年历史，表达了数百种外源基因，由于表达量不高及产物分离纯化难度和成本问题，至今未能进入产业化；家蚕转基因生物反应器有过比较好的尝试，改进转基因技术提高外源基因的整合率是今后主攻方向。
本文综述了家蚕BmNPV表达系统的研究现状及转基因家蚕生物反应器的研究进展及发展前景。
关键词：家蚕生物反应器BmNPV表达系统转基因家蚕发展前景ThereearchprogreofilkwormbioreactoranddevelopmentpropectAbtract：Currently,theilkwormbioreactorofreearchanddevelopmentimainly Keyword:Bomby某moribioreactor,BmNPVe某preionytem,Trangenic ilkworm,Developmentpropect前言：养蚕业起源于我国，是我国的传统产业，在长达5000多年的生产实践中，为我国的经济发展和中外文化交流作出了巨大贡献，在国民经济中占有重要地位。
家蚕(Bomby某mori）属于鳞翅目蚕蛾科，为开放式血管系统，纤薄而强韧的表皮层包围着一个充满血淋巴及各种器官的空间。
几千年来，人们利用家蚕能吐丝结茧这一生物机能，大量生产生丝。
家蚕丝因具有柔软舒适、透气保温、吸湿散湿性能好、珍珠般光泽、染色性强等优良理化特性，被誉为“纤维皇后”，其织出的华丽丝绸深受人们喜爱。
并且随着科学技术的发展，很多新的技术和试验方法在家蚕新用途和基础研究中得到应用和推广。
家蚕除用作生产蚕茧以抽取蚕丝这一传统用途外，作为生物反应器而生产高价值物质等新用途也不断被开发研究出来。
作为真核生物，家蚕生物反应器有着原核生物不可比拟的优点：外源基因的表达产物在家蚕体内后期加工完善，活性高，所以利用家蚕生产具特异性或经济价值高的蛋白质，已成为研究的一个焦点。
另外，由于家蚕饲养历史悠久，遗传背景清楚，以其为材料研究生物体基因组的精细结构、功能和基因的表达调控比其它动植物更具优势；转基因技术还可以缩短家蚕育种周期，在短时间内获得拥有目的性状的家蚕纯合体。
家蚕易于饲养,成本低廉。
家蚕1天内可合成3.69mg外源蛋白【1】,血淋巴具有储存蛋白的能力,淋巴内含有蛋白分解酶的抑制物,对目的蛋白起到保护作用,且外源蛋白又很容易从家蚕体液中分离纯化出来,还可以将家蚕直接磨碎用作药物或食品添加剂【2】因此,用家蚕生物反应器生产有用蛋白具有很大的优越性。
可以预见在不远的将来家蚕生物反应器给社会带来的效益将不可估量。
1、家蚕生物反应器概述生物反应器，是指利用酶或生物体（如微生物、动植物细胞）所具有的特殊功能，在体外进行生物化学反应的装置系统。
而“家蚕生物反应器”，主要是指将特定的重组杆状病毒（基因）植入家蚕（Bomby某mori）的蚕蛹体内进行培养，蚕蛹会主动对植入基因进行转录和翻译，自然合成对人类有用的生物活性物质（如生物药品、生物疫苗、保健食品等），通过高新技术(如超低温冷冻、低温干燥、高速离心等)，将生物活性成分萃取并制成相关剂型，来用于人类疾病的预防、保健和治疗。
2、家蚕生物反应器的建立方法家蚕生物反应器主要有两种形式；转基因家蚕(trangenicilkworm)和杆状病毒表达载体系统(BaculoviruE某preionVectorSytem，BEVS)。
本篇综述主要介绍了家蚕杆状病毒表达系统和转基因家蚕在近几年的研究进展及发展前景。
2.1基于杆状病毒的家蚕生物反应器家蚕杆状病毒表达系统最早是由Maeda于1984年开发出来，由于该系统潜在的诸多优势，为生产人类急需的蛋白类药物、基因工程疫苗和基因工程杀虫剂等提供了崭新的途径，因而近年来受到广泛关注。
2.1.1杆状病毒的家蚕生物反应器简述对于家蚕而言，其核型多角体病毒（Bomby某morinuclearpolyhedroiviru，BmNPV)是一种杆状病毒，病毒基因组为环状双链DNA，约130kb，含有100多个编码基因。
这种多角体蛋白基因具有强启动子，在感染末期多角体蛋白量达到被感染细胞内全部蛋白质的20%~30%【3】。
BmNPV多角体蛋白基因在感染末期有选择地进行表达，它所编码的多角体蛋白与病毒粒子的形成没有直接关系，只起到包埋病毒粒子的作用。
多角体蛋白基因即使部分或全部被外源基因取代，仍能形成有感染性的病毒粒子因此，可以将外源基因通过基因操作技术替换BmNPV基因中的多角体蛋白基因，从而使重组BmNPV在蚕体细胞内大量表达外源蛋白。
家蚕杆状病毒表达系统就是家蚕BmNPV表达系统，其有较强的启动子，可同时表达两种以上的外源蛋白。
外源蛋白表达水平高，产物的天然性质好且稳定，宿主范围狭窄，安全性好；它没有哺乳类细胞培养系统外源蛋白生产效率低、设备条件要求高等问题，也没有大肠杆菌的内毒素、表达产物糖苷化及生物活性低等缺陷，因而被广泛应用。
2.1.2家蚕重组BmNPV载体的构建目前，用于构建BmNPV的载体有两类，一类是单独表达外源基因（即非融合基因）的载体，另一类是以融合基因（即部分多角体蛋白编码序列与外源基因连接）形成的表达载体【1】【4】。
家蚕BmNPV表达系统首先利用多角体蛋白基因启动子及其他一些基因元件构建转移载体，将外源基因插入到多角体蛋白基因启动子下游形成重组质粒DNA，再把这一重组质粒DNA与野生型病毒基因组一起共感染家蚕细胞系，通过细胞内同源重组，使外源基因置换多角体蛋白基因，再进一步通过空斑筛选等方法分离、纯化出重组型病毒。
其中共转染家蚕细胞的方法主要有磷酸钙介导法、DEAE2葡萄糖介导法、polybrene介导转染法、原生质体融合法和电穿孔法等。
2.1.3家蚕细胞中外源基因的表达【5】重组的BmNPV经过构建并进行鉴定确认后，注射到上簇后6~9天的蚕蛹中，同时以野生型BmNPV为对照，放置于周转箱内室温（25℃）保存，4~5天后重组病毒在蚕蛹体内得到充分繁殖，目的蛋白得到充分表达。
此时就可以收集其血淋巴，经过常规的离心、沉淀、透析或色谱纯化等手段分离纯化外源蛋白。
收集时注意将盛放蚕蛹的周转箱放置于-18℃左右的冰柜中，或者冷冻24小时，直到蚕蛹体完全冻僵为止，然后集中放置在冷库中冷存备用。
2.1.4家蚕核型多角体病毒作为表达载体与其它动物病毒表达系统相比较其优越性在于【1】:(1)家蚕核多角体病毒的基因组为超螺旋的闭环双链DNA,容易切割、连接、重组和交换,便于加工和改造;(2)多角体基因编码区为非必要区,易为外源基因插入,允许插入外源基因的容量大,可同时表达两种以上的外源蛋白;(3)在强有力的多角体蛋白启动子的调控下,外源基因的表达水平高;(4)杆状病毒质粒既能表达原核基因又能表达各种真核基因、这些真核基因在昆虫细胞、可利用信号肽将目的蛋白分泌到胞外,还能有效地进行蛋白质翻译后的加工、转运、糖基化、脂酰化和磷酸化等,表达产物的抗原性、酶活力等生物学活性与天然蛋白质相比毫不逊色;(5)重组BmNPV不仅能在细胞培养液中表达,还能在蚕体内表达,血淋巴中含有蛋白分解酶的抑制物,表达产物稳定;(6)杆状病毒具有严格的宿主专一性,它对脊椎动物或植物均无致病性,也不能在非宿主细胞中繁殖或与之发生整合,是一种比较安全的表达载体。
总之,BmNPV表达系统对基因的无性繁殖和表达来说是一种快速、稳定、可靠的系统2.2.基于转基因的家蚕生物反应器研究现状及应用前景家蚕是研究真核生物基因表达调控的理想模式生物之一，又是一种重要的经济昆虫．因此，开展家蚕转基因研究具有重大的理论意义和经济效益．戎锐等【6】对家蚕转基因的研究作过总结，唐恒立等与1994年构建天蚕YAC文库，获得含天蚕丝素基因及上下游调控序列44Okb.李振刚等在1995年将天蚕丝素基因YAC克隆显微注入家蚕卵,天蚕丝素基因整合人家蚕基因组并在F2代中表达.家蚕转基因研究近几年又有了新的进展．Marhall【7】直接将外源基因置于丝心蛋白启动子的调控下，利用家蚕丝腺作为表达外源基因的生物反应器．张峰等【8】为改进蚕丝性能，首先在IE启动子调控下的gfp基因两端装配家蚕丝心蛋白重链基因的5＇和3＇序列，对重链基因进行打靶，希望获得不能吐丝的转基因家蚕，而后对这种转基因家蚕实施第二次基因打靶，引人其它性能优良的丝蛋白基因．结果从5000条蚕中筛选出3条具有荧光斑点的家蚕，Southern杂交证明对重链进行定向改良是可行的．但获得的转基因家蚕不能吐丝．赵昀等【9】改变了基因打靶的策略，人工合成一段丝心蛋白基因，使之与gfp基因融合后，装配在家蚕丝心蛋白重链基因的5＇和3＇序列之间，重新对重链基因进行打靶，卵孵化、发育和结茧后，用紫外灯检查，在约54O0个茧中有73个“亮茧”，茧蛋白在ELISA反应中可以与gfp的多克隆抗体反应．“亮茧”对应的蚕蛾进行交配、制种．对其后代进行了基因鉴定，Southern杂交的结果表明，gfp基因和人工合成丝心蛋白样基因都存在于家蚕基因组DNA中且发生了预期的同源重组事件．上述结果说明“亮茧”这一表型能用于筛选转基因蚕，融合基因已通过同源重组进人家蚕基因组．张峰等将线性化的含核酶基因的重组质粒PGL2Rz用基因枪导人家蚕早期受精卵中(G0代)．检测了G1代五龄蚕血淋巴的荧光素酶活性，并且从G2代开始通过家蚕核多角体病毒(NPV)攻击来筛选抗性较高的家蚕进行传代．在G4代获得一区NPV抗性强度比对照组高10倍的转基因家蚕．对该区五龄蚕基因组DNA的PCR检测和Southern杂交证明，核酶基因多拷贝地整合在家蚕染色体上．利用RT-PCR能检测到蛹期核酶的表达．研究结果表明已经获得了抗NPV的核酶转基因蚕．陈秀等【10】构建含新霉素抗性基因(neomycinreitancegene，noeR)的重组质粒pFN，经HindⅢ酶切后，用基因枪将DNA片段导人家蚕早期受精卵中(G0代)．孵化的G1、G2代蚁蚕均经含新霉素的人工饲料添食24h后，筛选出新霉素抗性的个体(能正常生长发育的)改为桑叶饲养．于G2代的5龄第2d从后部丝腺抽提总DNA，再以noeR的cDNA为探针进行Southern杂交检测．结果表明noeR基因已转人家蚕DNA中，获得了含／leo的转基因蚕．桂慕燕等【11】以含家蚕丝心蛋白重链基因同源片段的质粒pG350为出发质粒，插人增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因，构建成以EGFP为报告基因的同源重组质粒载体pMD-Fib—IE—EGFP，通过PCR及酶切鉴定表明EGFP以正确的方式插人到原始质粒中，通过脂质体介导法转染胃癌细胞能发出很强的绿色荧光，表明该质粒能够在真核细胞中表达，为进一步建立完善的家蚕转基因系统平台提供基因材料．朱成钢等【12】认为家蚕(Bomby某mori)的丝心蛋白启动子是自然界中最强的启动子之一，若能使外源基因在丝心蛋白启动子控制下得到表达，将具有重要的意义．研究从蚕蛹中提取家蚕基因组DNA，用PCR的方法克隆了丝心蛋白轻链基因的5kb和0．5kb两个片段．DNA序列分析表明，不同蚕品种2～7外显子范围内DNA序列同源性达95．7％．用PCR 的方法在GFP基因前端加上凝血酶的识别序列，并克隆到轻链基因的5kb 和0．5kb两个片段中间，使GFP基因具有正确的读码框，能和轻链蛋白融合表达．将这一融合的DNA大片段克隆到pBacPAK8转移载体上，构建成一种新型的转基因家蚕打靶载体pBacFL53TG，用于家蚕丝腺生物反应器的研究．2000年，Tamura等人利用显微注射法将携带有绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的pi翻妙Bac转座表达载体导入到家蚕早期胚胎1501，成功获得了表达EGFP的转基因蚕。