三、免疫细胞的检测
对机体参与免疫应答的细胞进行鉴定,计数 及功能测定 (一)细胞计数 1. 荧光抗体染色 2. 免疫酶染色技术: *ABC法 *APAAP法 3. 免疫金银染色法(IGSS) 4．免疫细胞化学法 5．四聚体法 6．TCR链测定
(二)免疫细胞功能的测定 1. T细胞功能测定：肿瘤，病毒感染，免疫
免疫学检测与免疫学技术
一、抗原抗体的检测技术 二、免疫细胞的检测 三、细胞因子的检测 四、免疫相关基因分析 五、免疫标记技术 六、免疫PCR(IM-PCR)技术 七、杂交瘤技术与T细胞克隆技术 八、新型抗体的制备技术 九、抗原的制备技术
一、概述 免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列 测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因 子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究 中的应用。 免疫学技术的应用极为广泛,疾病的诊断、 疗效评价及理论研究等。 二、抗原抗体的检测技术 * 根据反应的基本原理与表现主要分为凝集 反应、沉淀反应和补体参与的各种反应 *根据抗原抗体反应设计的试验还有标记抗 原(或抗体)检测相应物质的标记技术。
(4)化学发光法
(5)流式细胞术：应用FCM检测NK细胞活性是
根据PI染料排斥法。PI渗入死亡细胞内与DNA 和RNA结合，在488nm波长激发下产生绿色荧 光。此法既可以测定单个细胞毒活性，也可以 用于总细胞毒活性试验。 *还可利用荧光染料法,细胞光扫描法，双标记 细胞毒法测定细胞毒性细胞的杀伤效应。
四、细胞因子的检测
（一）免疫学检测法
免疫学检测的基本原理是将细胞因子作 为抗原进行定量检测。如免疫斑点法、 ELISA 法、 RIA 法和免疫印迹法等均已用于 细胞因子的检测。某些细胞因子含量甚微的 样品(如脑脊液)可用免疫聚合酶链反应 (immuno-PCR)进行检测。
（二）生物学测定法

1. 促进细胞增殖和增殖抑制法 * 多种 IL 、表皮生长因子、转化生长因子 α 、 神经生长因子、血小板衍生生长因子、成纤维 细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子 *各种CSF作用于造血系统的不同细胞,可 促进其增殖及在半固体琼脂凝胶系统中克隆培 养骨髓细胞的集落形成,故可采用集落形成试验 研究CSF的水平 *常用的检测细胞增殖的方法有3H-TdR掺 入法、比色法、染色法和直接计数法等。其中 测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的比色法包括 MTT、XTT、MTS和NAG等方法。

2. B细胞功能判定 (1)B细胞增殖(转化)试验： *PWM、SAC，LPS（对小鼠B细胞）； *抗IgM抗体及EB病毒等 (2)溶血空斑形成试验 (3)反向溶血空斑试验 (4)酶联免疫斑点法(ELISPOT):ELISPOT是一种 可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体 外实验方法。 *此法的主要优点是: ① 稳定、特异，且抗原用量少； ②可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定 量测定； ③可检 细胞毒活性测定法 许多细胞因子 (TNF) 针对转化的细 胞及病毒感染的细胞具有溶细胞或抑制 细胞生长的活性。

3.抗病毒活性测定法 常用于检测抗病毒活性的细胞株有 WISH,Hep2/c,L929,A549 和 MDBK 等 。 其 中 WISH和Hep2/c细胞株用以检测人干扰素 ,L929 细胞株用于检测小鼠干扰素 ,Ratec 细胞株用于 检测大鼠干扰素 , 而 MDBK 细胞株则可用于检 测多种族的IFN-α和IFN-γ。 常用于攻击细胞的病毒有滤泡性口炎病毒 (VSV) 、鼠脑心肌炎病毒 (EMCV) 以及 Sindbis virus等病毒。 检测抗病毒活性的方法:测定细胞因子抑 制病毒的致细胞病变效应(CPE)、抑制病毒蚀 斑形成或抑制病毒的产量等。
3. NK细胞活性测定 体外检测NK细胞活性的方法有形态学检查
法，放射性核素释放法，酶释放法，化学发光 法及流式细胞术等。测定人NK细胞活性常以 K562细胞株作为靶细胞，测定小鼠NK细胞活 性常用YAC－1 细胞为靶细胞。 (1)形态学检查法 (2)放射性核素释放法：用放射性核素(51Cr、 125I －UdR)标记靶细胞。 (3)酶释放法：测定靶细胞膜受损后从胞浆内 释放至介质中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。 *NAG酶荧光比色法:NAG酶是细胞浆中存在的 一种溶酶体酶,与其底物作用后,生成荧光产物, 应用荧光分光光度计测定，敏感性明显高于 LDH比色法。而且方法简单，结果稳定，重复
4．吞噬细胞功能测定 (1) 中性粒细胞趋化功能测定：一般采用滤膜渗 透法(Boyden小室法)或琼脂糖平板法。 (2)中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定 1)显微镜检法 2)NBT 试验：此项试验是测定中性粒细胞吞噬、 杀菌功能的一种简易方法。 3) 化学发光测定法：中性粒细胞在吞噬过程中 出现呼吸爆发 ,产生活性氧代谢产物。此类活性 氧化基团与细胞内杀菌作用密切相关，同时又 能激发细胞内某些物质产生化学发光。
缺陷，自身免疫病等 (1)细胞增殖(转化)试验：可分为非特异性丝 裂原和特异性抗原两类。 *丝裂原主要有PHA、Con A和PWM； * 抗原刺激物有破伤风类毒素、 PPD 和白色 念珠菌等； *同种MHC及抗CD3单抗等 *肿瘤细胞-自体淋巴细胞混合培养 (2)T细胞介导的细胞毒试验：CTL (3)分泌功能检测 (4)T细胞功能的体内检测法 *接触性超敏反应*移植物抗宿主反应
(4) 巨噬细胞细胞毒测定 : 通常取小鼠腹腔巨
噬细胞，以 - 干扰素为激活剂使其活化，作 为效应细胞。用 125I-UdR 标记的 DBA/2 小鼠 肥大细胞瘤P815作为靶细胞。 (3)巨噬细胞吞噬功能测定：中药斑蝥酒精浸 液敷贴法诱发无菌性皮炎，从皮肤水泡渗出 液中收集巨噬细胞，在体外进行鸡红细胞吞 噬试验，计算吞噬率和吞噬指数，作为判断 巨噬细胞吞噬功能的指标。
根据细胞因子对特定的生物学活性 , 应用 相应的指示系统 ,同时与标准品对比测定 ,从而 得知样品中细胞因子的活性水平 , 一般以活性 单位(U/ml)表示。 靶细胞可直接从组织中分离 , 如骨髓细胞的 集落形成试验和胸腺细胞(脾细胞)的增殖试验, 或用体外培养的依赖细胞因子才能生长的细胞 因子依赖株及对细胞因子杀伤敏感的细胞作为 靶细胞。