实验三花粉生命力的测定与形态观察花期不遇，给杂交工作造成困难，有的树木和园林植物可通过催延花期解决，有的则不得不进行花粉贮藏，为此我们必须掌握花粉贮藏的原理与技术。

为了避免杂交工作失误，在使用远地寄来的花粉或经过一段时间贮藏的花粉之前，必须对花粉生命力进行鉴定，以便对杂交成果进行分析与研究。

一、实验目的掌握了解花粉贮藏及花粉生命力鉴定的方法及原理。

二、实验材料芙蓉花的花粉。

三、仪器及药品载玻片、盖玻片、标签、标记笔、显微镜、蔗糖、蒸馏水、联苯胺、 -萘酚、酒精、碳酸钠、过氧化氢、琼脂。

四、实验原理在园艺植物有性杂交工作中，常因杂交亲本间花期不遇，或父本植株栽在异处(地)而必须预先收集花粉。

花粉贮藏在低温(0～4℃)、干燥(相对湿度0～40％)、黑暗的环境下，代谢降低，可以较长时间地保持花粉生活力，但其贮藏期长短对花粉生活力的影响因品种而不同。

在授粉之前，对贮藏的或外地采来的花粉必须预先测定花粉的生活力，以确定哪些花粉不能用于杂交，这对取得杂交效果有直接影响。

一是将待测花粉直接授粉，然后统计结实率和结子数。

此法的缺点是需时间较长，且实验结果易受气候条件的影响；二是将待测粉受到柱头上，隔一定时间切下柱头，在显微镜下检查花粉的萌发情况，根据萌发率的高低来鉴定花粉的生命力；三是在培养基上进行花粉的人工萌发，检查待测花粉萌发率的高低。

将花粉播种在特定的培养基上，并在一定的环境条件下来测定其发芽能力的方法。

培养基常用蔗糖、琼脂(1％)和蒸馏水配制而成。

不同植物的花粉，对蔗糖浓度要求不同，如柑桔花粉要求25％左右，苹果和梨10～15％，桃10％左右为宜。

蔗糖浓度高低可调节培养基的渗透压，以防止花粉在培养基上破裂。

培养基以微酸性为宜，一般在pH5.2～6之间。

发芽温度在20～25℃左右，并需要空气和湿度，为了促进花粉发芽，在培养基中还可加入少量的硼酸和维生素B1。

利用花粉发芽试验测定花粉生活力是一种直接的测定方法，其结果也最可靠，但操作较麻烦，要有一定设备和一定时间。

四是用染色方法来鉴定花粉的生命力。

其原理是在活的花粉内有过氧化氢酶存在。

它可以促进过氧化物(如HO)放氧分解。

这些刚被放出的活性氧很容易使还原剂氧化。

在本实验中所用的无色联苯胺 -萘酚都是还原剂，但他们被氧化后却都表现红色或玫瑰红色。

如果花粉是活的，那么这个反应很快，则花粉被染成红色或玫瑰红色；如果花粉是死的，则这一反映迟迟不能进行，花粉也就保持原色。

此色优点是比较快捷，但比较间接。

利用化学药剂染色的方法测定花粉生活力，这是一种间接的测定方法，简便而快速，但比较粗略，有时不能真实反映出有发芽力花粉的数量。

五、实验步骤1、花粉发芽试验（1）培养基的配制：在100ml的蒸馏水中，加入琼脂1g、蔗糖15g，置于烧杯中加热煮沸，然后将该烧杯置水浴锅或盛热水的杯中备用，以防培养基冷却凝固。

（2）发芽床的设置和播撒花粉：在盖玻片上滴一滴培养基，用头发蘸上花粉少许，均匀撒于培养基表面，但应防止花粉埋入培养基中而影响花粉发芽。

播撒花粉后，要在显微镜下检查花粉是否分布均匀，再将载玻片置入用湿纱布或湿滤纸垫底以保湿的大培养皿中，盖上皿盖。

在各载玻片上贴上标签，注明花粉种类、采集时间、蔗糖浓度、播粉时间和操作者，然后置于20～25℃的温箱中。

（3）播花粉后的检查：在播花粉后，根据不同植物，经不同时间，在低倍镜下检查花粉发芽情况。

实验在24h 后观察，三个视野，统计发芽情况。

表3-1花粉发芽力测定记载表2、花粉生活力测定间接测定花粉生活力主要采用化学药剂染色法，通常采用以下几种方法。

（1）碘-碘化钾染色测定法①原理：正常的花粉积累淀粉较多，而不正常的花粉则少，据此可用化学物质染色，根据呈色反应来间接测定花粉的正常与否和花粉生活力的差别。

通常正常花粉用I2-KI染色后呈蓝色，而发育不良畸形的花粉则不积累淀粉，当用I2-KI 染色时呈黄褐色。

②试液的配制碘片 0.5g碘化钾 1.0g蒸馏水 150 ml先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成③步骤和方法：取花粉撒于载玻片上，加1滴蒸溜水，用镊子使花粉散开，再加一滴I2-KI溶液，盖上盖玻片置于显微镜下观察，凡被染色呈蓝色者表示具有生活力，呈黄褐色者为发育不良缺少生活力的花粉。

（2）过氧化物酶测定法①原理：具有生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶，它能使过氧化物放出活性氧，氧是在花粉萌发，进行许多综合反应时必需的，使各种多酚及芳香族胺发生氧化而产生特定颜色。

因此，通过对过氧化物酶测定后的呈色反应来间接判断花粉有无生活力。

+2H2O②试液的配制Ⅰ. 0.20g联苯胺溶于100ml的50％酒精溶液中。

Ⅱ. 0.15gα-萘酚溶于100ml的50％酒精溶液中。

Ⅲ. 0.25g碳酸纳溶于100ml的蒸馏水中。

以上三种溶液分别放入棕色瓶中备用，使用时将这三种溶液等量配成试剂A，放入棕色滴瓶中备用。

使用前配制0.3％H2O2液为试剂B，装入棕色滴瓶中备用。

③步骤和方法：取花粉少量撒于载玻片上，加上试剂A和试剂B各一滴，用镊子使花粉散开，盖上盖玻片，在30℃条件下经10min后置于显微镜下观察。

被染色后呈红色的花粉粒，则表示有过氧化物酶存在，花粉有生活力；能发芽，如呈黄色或无色，则表示无生活力。

（3）氯化三苯基四氮唑(TTC)法①原理：凡具有生活力的花粉，在其呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生活力的花粉则无此反应。

因此，当TTC渗入有生活力的花粉时，花粉中的脱氢酶在催化去氢过程中与TTC结合，使无色的TTC变成三苯基甲(TTF)而呈红色。

②试液的配制Ⅰ.磷酸盐缓冲液。

在100ml的蒸馏水中，溶解0.832g的Na2HPO4·2H2O和0.273g的KH2PO4，调整pH值为7.17。

Ⅱ.TTC溶液。

称取0.02～0.05g的TTC，溶解在10ml的磷酸盐缓冲溶液中，放入棕色滴瓶内，置于暗处。

TTC为有毒性物质，操作时应注意安全。

Ⅲ.步骤和方法。

取少量花粉放在载玻片上，在花粉上滴1～2滴的配制液，用镊子使其混合后，盖上盖玻片。

将此载玻片置于人工气候箱中(35～40℃)约15～20min。

在显微镜(100倍)下观察，凡具有生活力的花粉粒呈红色，其次呈淡红色，失去生活力的和不育的花粉粒表现无色。

本实验用第（1）和第（2）种方法每种每人制片2片，每片观察3个视野，每视野约有50粒花粉，统计每种测定方法中具有生活力花粉的百分率，将观察结果记入表1。

五、实验结果与分析根据试验结果，试比较花粉发芽试验和几种花粉生活力染色测定法的优缺点及其应用价值。

六、关键步骤与注意事项花粉采集时期要适宜，取充分成熟将要开花的花朵带回室内，取其内部的花粉。

七、思考题试比较用2种方法测定的同一花粉的活力百分率是否相同，分析其原因。

备注：花粉生命力的鉴定1 固体培养基法(1) 配置培养基：称取1g琼脂、5g蔗糖(化学纯)，量取94ml的蒸馏水。

先把水加热煮开，倒入洋菜，使之融化，然后到入蔗糖，用玻棒不断搅拌，呈透明状即可。

为保持培养的浓度，可在烧杯上用玻璃铅笔做记号，如水分蒸发应徐徐补充，既配成5%浓度的培养基。

同法配成10%、15%、20%浓度的培养基。

(2) 载平：用玻璃棒蘸少量培养基，趁热滴在载玻片的凹槽，放置片刻，使其冷凝。

（3）播种花粉：将上述处理的载玻片置于黑色纸上然后用解剖针粘少量花粉均匀地撒在培养基上，但不可过多，否则为以后观察带来困难。

(4) 观察：把植被好的片子放在有湿润吸水纸的培养器内，然后盖上盖、放在20~22℃的温箱中培养。

接种1h即可统计萌发率。

随即在显微镜下取3个视野，计算花粉总数及发芽数，算出平均出芽率。

2 悬滴培养法(1) 配培养液：称取5g蔗糖(化学纯)量取95m1蒸馏水，先把水加热烧开，然后到入蔗糖，用玻璃棒搅拌即成5%的培养基。

(2) 载植：用蜡环(或玻璃环)和凡士林在悬滴载片的凹点上做一围墙，蜡环(或玻璃环)上缘涂一层凡士林，并往凹点内滴一滴培养液。

然后均匀地撒上少量花粉，拿好盖玻璃片在往上提的过程中迅速将它翻转过来(利用这个惯性保持其球面)小心地把玻片平放在蜡环(或玻璃环)上并使其周围没有缝隙。

如此便构成了一成密闭的小室。

(3) 观察：把上述制成的片子小心放到培养内(注意在所有悬滴过程中不能使悬滴流跑)然后放到温箱中，保持22~ 22℃的温度。

牡丹花粉接种后1h即可观察。

花粉发芽检查在低倍镜下进行，花粉的长度为花粉粒直径2倍以上才算发芽，1倍以上者算萌芽。

2.3 染色法(1) 配制溶液A. 20g联苯胺溶于10ml的酒精中，盛入棕色瓶中。

B. 0.15g -萘酚溶于100ml的酒精中，盛入棕色瓶中。

C. 0.25g碳酸钠溶于蒸馏水中，盛入白色瓶中。

D. 以上三种溶液等量混合，即成“甲液”，盛入白色瓶中。

E. 将36%过氧化氢，临用前用蒸馏水稀释成0.36%溶液，即成“乙液”。

(2) 制片：取少量花粉放到悬滴载玻片的凹点内，滴入一滴甲液，再滴一滴0.36%的H2O2，3min之后观察。

(3) 统计存活率：在显微镜下观察凡表现红色或玫瑰红色的都有生命的花粉。

黄色或不着色者为没有生命的花粉。