医学分子生物学杂志,2007,4(1):86290 J Med Mol B i ol,2007,4(1):86290通讯作者:汤华(电话:022*********,E 2mail:htang2002@yahoo 1co m )Corres ponding author:T ANG Hua (Tel:86222223542603,E 2mail:htang2002@yahoo 1co m )基因敲除技术现状及应用万海英 综述 汤华 审阅天津医科大学天津市生命科学中心实验室 天津市,300070【摘要】 功能基因组学的研究进展使基因敲除技术显得尤为重要。
基因敲除技术从载体构建到细胞的筛选到动物模型的建立各方面都得到了发展。
其中C re 2LoxP 系统可以有效的控制打靶的发育阶段和组织类型,实现特定基因在特定时间和(或)空间的功能研究;转座子系统易于操作,所需时间短,具有高通量的特点,可以携带多种抗性标记,方便了同时进行多基因功能研究;基因捕获技术提供了获得基因敲除小鼠的高效方法,方便了进行小鼠基因组文库的研究。
此外,进退策略、双置换法、标记和交换法、重组酶介导的盒子交换法也从不同方向发展了基因敲除技术。
【关键词】 基因敲除;C re 2LoxP 系统;转座子;基因捕获【中图分类号】 R34918St a tus Quo and Appli ca ti on of Gene KnockoutWAN Haiying,T ANG HuaTianjin M edical U niversity,Tianjin L ife Science Center ,Tianjin,300070,China【Abstract 】 Gene knockout is i m portant f or functi onal genom ics 1Great p r ogress has been made inthe vect or constructi on of gene knockout,screening of ai m ed cells and ani m al models and the devel op 2ments in these fields hel p t o s olve the p r oble m s in the study of genom ic functi ons 1Cre 2LoxP syste m can effectively contr ol the devel opment stage and hist ol ogy of gene knockout,thereby making it possi 2ble t o study gene functi on in a given ti m e and /or s pace 1Trans pos on syste m is easy t o mani pulate,quick and can achieve high thr oughput,carry multi p le resistance marker gene,which makes si m ulta 2neous study of multi p le genes possible 1Gene trapp ing p r ovides a highly efficient method of obtain knockout m ice and can facilitate the research of m ice geno m ic library 1I n additi on,the techniques such as “hit and run ”,“double rep lace ment ”,“tag and exchange ”and “recombinase 2mediated cas 2sette exchange ”all contribute t o the devel opment of gene knockout technol ogy 1【Key words 】 gene knockout,Cre 2LoxP syste m,trans pos on;gene trapp ing 基因敲除又称为基因打靶,是指从分子水平上将一个基因去除或替代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法。
基因敲除技术是功能基因组学研究的重要研究工具。
基因敲除技术是在20世纪80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。
胚胎干细胞(e m 2bry onic ste m cell ,ES 细胞)分离和体外培养的成功及哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的技术基础和理论基础[1]。
基因敲除主要包括下列技术:①构建重组载体;②重组DNA 转入受体细胞核内;③筛选目的细胞;④转基因动物。
基因敲除传统的重组载体主要有插入性载体系统和替换性载体系统。
插入性载体系统构建载体时主要包括要插入的基因片段(目的基因)、同源序列片段、标志基因片段等成分,替换性载体系统主要包括同源序列片段、替换基因的启动子、报道基因等成分。
基于正负双向筛选(positive and negative selecti on,P NS )策略的传统方法的基因敲除需要满足:对基因组提取处理用于构建载体;需要位于打靶区两翼的具有特异性和足够长度的同源片段,并便于用其作为探针用Southern 印迹证实;neo 基因(新霉素磷酸转移酶基因)的整合;同源重组区域外侧tk 基因(胸苷激酶基因)在随机重组时的活性;打靶结构外特异的基因探针;合适的酶切位点,便于用Southern印迹证实过程中出现特异大小条带。
重组后不能排除由于基因对位置改变产生的影响,长距离PCR中特殊序列的技术问题,不能控制打靶的组织类型及发育时段,需时较长花费较大,这些都限制了研究工作的进行。
近年发展起来的C re2 LoxP系统或F1p2FRT系统及转座子系统、基因捕获技术。
分别从不同方面解决了上述基因敲除中的问题。
1 C re2L oxP系统C re2LoxP系统属于传统的同源重组载体,但是具有了时空调控的功能。
它由C re重组酶和LoxP位点两部分组成。
前者来自E.coli噬菌体P的C re基因,LoxP由2个13bp的反向重复序列和1个8bp 的间隔区域构成。
C re是1个38ku的重组酶蛋白,它可以介导LoxP的34bp重复序列的位点特异性重组,切除同向重复的2个LoxP位点的DNA片段和1个LoxP位点,保留1个LoxP位点[226]。
与传统的重组载体相比较,C re2LoxP的不同点包括:在被C re重组酶介导的重组发生前内源基因功能正常,对基因组的任何改造必须位于编码区以外或者内含子区并且不干扰调节区域的功能;根据删除片段的要求改变LoxP位点的插入方式可以得到不同的重组体;每段被改造的DNA片段都含有酶切位点便于用S outhern印迹证实;便于区分打靶后不同细胞类型(野生型、打靶但未重组型、重组型)的显像策略。
研究者发现,在不同时期通过导入C re重组酶,可以精确控制基因重组的时段。
将该系统用于条件性切除小鼠成熟Sch wann细胞有丝分裂期和有丝分裂后期Mat1蛋白,揭示其在转录中是调节性作用而不是必需的成分[7]。
C re不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域,而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组[3]。
利用这一特点,人们在进行构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列用于基因突变或修复,增加了该系统的应用范围。
重组酶介导的盒式交换(recombinase2mediated cas2 sette exchange,R MCE)方法就是以8bp的间隔区发生改变为基础构建的;同时结合盒式交换来突现动物的表型而易于鉴别[8]。
C re2LoxP系统既可以在细胞水平上用C re重组酶表达质粒转染中靶细胞,通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除[6];又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与C re转基因小鼠杂交,筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠[9210],用该系统删除小鼠X染色体雄激素受体基因产生雄激素受体基因缺失小鼠,揭示了雄激素受体功能是正常雌性动物生产能力所必需的,雄激素受体是一种治疗卵巢功能早衰的潜在的治疗性靶基因。
或者将C re基因置于可诱导的启动子控制下,通过诱导表达C re重组酶而将LoxP位点之间的基因切除(诱导性基因敲除),实现特定基因在特定时间或者组织中的失活[1,4],例如应用四环素诱导的开关系统诱导C re重组酶的暂时表达,来调节Rosa26的表达。
C re2LoxP系统还可以用于染色体间的基因重排。
通过在特异性位点同源重组导入含有LoxP序列的5′Hprt框,然后随机整合含有LoxP序列的3′Hprt框,在C re酶的作用下,两个LoxP位点之间发生重组,形成具有功能的Hprt微小基因,使重组后的ES细胞在选择培养基中存活下来。
这种染色体重排为染色体功能图谱的制作提供了一个很好的技术手段[2]。
总之,C re2LoxP系统可以实现对基因的不同发育阶段、不同组织类型中特异性的删除,可以消除由于基因位置改变造成的影响,加强了对基因的控制能力,使研究者可以更方便地有针对性地进行目标阶段的研究工作;C re2LoxP系统可以实现染色体间的基因重排;但同时也可以看出该系统对基因的了解要求极高,并且对基因片段的操作能力要求也很高,基因片段的大小通常在10kb以上,这些都不利于研究工作进行。
2 转座子系统转座子(trans pos on)是在多种生物(包括玉米、蠕虫、昆虫、人类等)中可被识别的可以移动的基因单位。
它的结构主要包括双侧末端重复序列及中间的抗性基因、转座酶读码框等。
转座子系统自从20世纪50年代被McClint ock发现以来,已经成为许多组织器官进行基因分析的工具。
在人和小鼠的基因组中,转座子衍生序列多达整个基因组的40%,这提示在发育过程中转座子有重要作用。
睡美人转座子(sleep ing bueaty,转座子S B)已证明在小鼠和人细胞中可以激活,但是转座子插入序列被限制并集中于起始位点附近,从而限制了DNA片段的携带。
在最近的研究中发现,S B转座子通过再觉醒机制激活后可以稳定的表达所携带的基因,使研究者又开始关注其发展[11]。
夸娥转座子(p iggy Bac,P B转座子)的发现成功地解决了DNA 片段的携带限制这一问题。
P B转座子有2472bp,有13bp的反向末端重复序列和一个594个氨基酸的・78・医学分子生物学杂志,2007,4(1):86290 J Med Mol B i ol,2007,4(1):86290转座酶[12]。