按上述操作制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。根 据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在 进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL稀 释液加入2个无菌平皿作空白对照。
倾注培养基
液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形 瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
样品稀释接种
用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无 菌试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
225ml生理 盐水
各1ml
各1ml
各1ml
各1ml
PCA
边倒边摇匀
46±1℃保温
······
冷却倒置
36±1 ℃
样品预处理
固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225 mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内， 8000r/min～10000 r/min均质1min～2min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用 拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。
食品微生物检验技术（四）
菌落总数测定
菌落总数定义
菌落的概念： 菌落（colony）是指细菌在固体培养基上经培养后生长
繁殖而形成的能被肉眼所识别的生长物集落，它是由数以 万计的相同细菌集聚而成的。 菌落总数的定义： 样品经过处理，在一定条件下培养后(如培养基成分、培 养温度和时间、pH、需氧性质等)，单位质量（g）、容 积（mL）或表面积（cm2）检样中所含细菌菌落的总数。 所得结果包括一群在方法规定的条件下生长的嗜中温的需 氧和兼性厌氧菌。
菌落总数的计算方法
若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的 平均值再将平均值乘以相应的稀释倍数，作为每g(ml)中的菌落总数结果。
若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下列公式计算： N= ∑C /[n1+(0.1×n2)]×(d)
菌落总数的报告
菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约。 大于或等于100时，前第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，
不同稀释度的平均菌落数
10-1
10-2
10-3
空白
菌落计数方 法
结果报告
1
1468、 1432
176、172
20、22
0、0
17000
2
1102、 1008
较大片状 菌落生长、
及时将15mL～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注 平皿，并转动平皿使其混合均匀。
如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼 脂培养基（约4mL）。
培养
培养温度，应根据食品种类而定。肉、乳、蛋类食品用37℃培养，水产品用30℃培 养。培养时间为48h±2h。其他食品，如清凉饮料、调味品、糖果、糕点、果脯、酒 类（主要为发酵酒）、豆制品和酱腌菜均系37℃，24h±2h培养。 培养温度和时间之所以有所不同是因为在制定这些食品卫生标准中关于菌落总数的规 定时，分别采用了不同的温度和培养时间所取得的数据之故。水产品因来自淡水或海 水，水底温度较低，因而制定水产品细菌方面的卫生标准时，系用30℃作为培养的 温度。
菌落总数测定---卫生学意义
及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品 卫生学评价提供依据。
判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。可用来预测食 品贮藏期限（保质期）。
通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染 的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食 品卫生质量的优劣。
菌落总数测定---卫生学意义
及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品 卫生学评价提供依据。
判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。可用来预测食 品贮藏期限（保质期）。
通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染 的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食 品卫生质量的优劣。
菌落总数的检验程序图
检样
10倍系列稀释
后面用0代替位数来表示结果；也可以用10的指数形式来表示，此时也按“四 舍五入”原则修约采用两位有效数字。 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 称重取样以cfu/g为单位报告，体积取样以cfu/mL为单位报告。
菌落计数方法举例
例次
选择2-3个适宜样品匀液，各取1mL分别加入无菌培养平皿内
每皿内加入适量培养基(PCA)
如果怀疑样品中含有在培养基表面 蔓延生长的菌落，待琼脂凝固后， 在其上覆盖一层（4mL）水琼脂。
倒置培养
36±1℃
48±2h ＊
菌落计数
平板叠放不 超过6个
报告
固体样品菌落总数检测流程
25g
固体 样品
移1ml
101
菌落计数
其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无 片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到 平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个 平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
平板内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，则应将每 条链（不同来源）作为一个菌落计。

102
103
移1ml
各移9ml
均质
空无菌 试管
···· ··
空白 生理盐水
225ml生理盐 水
各1ml
各1ml
各1ml
各1ml
PCA
边倒边摇匀
46±1℃保温
······
冷却倒置
36±1 ℃
液体样品菌落总数检测流程
25ml
10 10 1 移1ml
2
移9ml
液体 样品
摇匀
空无菌 试管
···· ··
空白 生理盐水
菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数 量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，cfu）表示。
选取菌落数在30cfu～300cfu之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低 于30cfu的平板记录具体菌落数，大于300cfu的可记录为多不可计。每个稀释 度的菌落数应采用两个平板的平均数。