食品微生物学检验
徐州质检所 李美桃
基本内容
菌落总数测定 大肠菌群测定 霉菌和酵母菌计数 罐头食品商业无菌的检验 乳酸菌饮料中乳酸菌检验 涂抹试验和空降试验
菌落总数测定
定义 食品检样经过处理,在一定条件下培养后(如 培养基成分,培养温度和时间,PH,需氧性质等), 所得1ml(g)检样中所含菌落的总数.本方法规 定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养 琼脂上生长发育的嗜中温需氧的菌落总数。 意义 菌落总数主要作为判定食品被污染程度的 标志,也可以观察细菌在食品中繁殖的动态,以 便对被检样品进行卫生学评价时提供依据.
菌落总数测定
注意事项: 如果稀释度大的平板上菌落数反而比稀释度小 的平板上菌落数高,则系检验过程中的差错,也 可能是抑菌剂混入样品所致,均不可用作菌落 计数的依据. 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜 采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀 释度的菌落数,若片状菌落不到平板的一半,而 其余一半中菌落分布又很均匀,则可计算半个 平板后乘2以代表全皿菌落数.
大肠杆菌
影响革兰氏染色因素
革兰氏染色的结果，可受许多因素影响，造成错 误的染色反映，导致错误的鉴定结果。 • (1)操作技术因素 涂片不要过厚，应保持细菌分散均匀， 固定时应避免菌体过分受热，脱色时间应反复实践积 累经验，根据标本性质而灵活掌握。一般以流下的脱 色剂不带有颜色即可。 • (2)染液的因素 所用染液均应防止水分蒸发而影响浓 度，特别是碘液存放太久或受光的作用而形成碘酸， 而失去媒染的作用，故应保存于棕色磨口滴瓶中，若 发现碘色已淡则应弃取。脱色酒精浓度95%为好，如 果浓度不够或涂片上积水过多均可影响脱色不好。 • (3)细菌本身因素 注意菌龄，一般以18-24h培养效果 较好，如细菌过于衰老或死亡，G+菌结果可呈G-菌反 应。
大肠菌群测定
检验方法
乳糖发酵实验.以无菌操作采取样品,作几个10 倍递增稀释液,选取3个适宜的稀释度接种乳糖 胆盐发酵管,每个稀释度接种三管,36±1℃培 养24±2h. 若都不产气,可报告为大肠菌群阴 性,如有产气者,按下列程序进行.
分离培养. 将产气的发酵管分别转种在伊红美 蓝琼脂平板上, 36±1℃培养24±2h,取出后观 察菌落形态,并做革兰氏染色和证实实验.
为了控制污染,在检验的同时,于工作台上打开一块琼脂平板,其暴
露的时间应与该检样从制备,稀释到加入平皿时所用的最长时间相 当,然后与加有检样的平皿一并置于温箱内培养.
培养温度应根据食品种类而定.
菌落总数测定
测定过程中的一些要求和规定
(四) 对照试验
加入平皿内的检样稀释液,有时带有食品颗粒.为了避
菌落总数测定
稀释度的选择
稀释液及菌落数 例 次 10-1 10-2 10-3 两稀释 液之比 菌落总数/ [cfu/g(ml)] 报告方式/ [cfu/g (ml)]
1
2 3 4 5 6 7
多不可计
多不可计 多不可计 多不可计 27 0 多不可计
164
295 271 多不可计 11 0 305
20
培养条件 36±1℃48±2h 菌落计数 选择菌落数在 30 ～300的平皿
霉菌在孟加拉红培养基 上典型特征
酵母菌在孟加拉红培养基 上典型特征
霉菌和酵母计数
注意事项 做递增稀释时,应用灭菌吸管反复吹吸50 次,使霉菌孢子充分散开. 培养3天后就开始观察,以防有的菌落蔓 延生长,不利于计数. 霉菌和酵母在培养基都可以生长,报告结 果时应注意区分.
罐头食品商业无菌的检验
• 三. 接种培养 培养基 管数 培养条件/℃
2
2 2
时间/h
96～120
24～72 96～120
低 酸 性
酸 性
庖肉培养
庖肉培养 溴甲酚紫葡萄糖肉汤(带倒管)
36±1(厌氧)
55±1(厌氧) 36±1(需氧)
大肠菌群测定
检验注意事项
培养基 EMB平板 黑紫色 有金属光泽 无金属光泽 粉红色 粉色
30/30(100) 133/153(86.9) 53/95(55.8) 37/69(53.6)
挑选菌落.菌落的色泽和形态等方面与大肠菌群 的检出率密切相关,所以在实际工作中,我们应当 熟悉大肠菌群的色泽和形态. 在伊红美蓝琼脂平 板上大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽,检 出率最高;红色,粉色菌落检出率较低.另外,挑取 菌落数与检出率有密切关系.所以挑取菌落时应 选取典型菌落,如无典型菌落则应多挑取几个.
46 60 313 5 0 12
-1.6 2.2 -----
16400
37750 27100 313000 270
16000或1.6×104
38000或3.8×104 27000或2.7×104 313000或3.1×105 270或2.7×102
＜1×10
30500
＜10
31000或3.1×104
基本内容
菌落总数测定 大肠菌群测定 霉菌和酵母菌计数 罐头食品商业无菌的检验 乳酸菌饮料中乳酸菌检验 涂抹试验和空降试验
大肠菌群测定
术语和定义 大肠菌群系指一群能发酵乳糖,产酸产气, 需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆 菌.该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为 粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推 断食品中有否污染肠道致病菌的可能. 食品中大肠菌群数系以100ml(g)检样内 大肠菌群最可能数(MPN)表示.
菌落总数测定
注意事项: 平板内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显 界限),若仅有一条链,可视为一个菌落;如果有 不同来源的几条链,则应将每条链作为一个菌 落计. 如果所有平板上都菌落密布,不要用多不可计 作报告,而应在稀释度最大的平板上任意数 2cm2中的菌落数,然后换算到整个平皿,再乘 以稀释倍数报告.
检验注意事项 MPN检索表. 最可能数(MPN)是表示样 品中活菌密度的估测. MPN检索表是采 用三个稀释度九管法,稀释度的选择是基 于对样品中菌数的估测,较理想的结果应 是最低稀释度3管为阳性,而最高稀释度3 管为阴性. MPN检索表给出了95%的可 信限.
大肠菌群测定
革兰氏染色
基本步骤： 涂片固定—— 结晶紫初染1min—— 碘液 媒染1min——95%乙醇脱色0.5min—— 沙黄 复染1min 结果: 革兰氏阳性菌——紫色； 革兰氏阴性菌——红色。
罐头食品商业无菌的检验
• 一.保温(膨胀)试验 保温过程应每天检查,如有胖听或泄漏等 现象,立即剔出做开罐检查.
种类 低酸性罐头食品 酸性罐头食品 预定要输往热带地区(40 ℃ 以上)的低酸性食品 温度/℃ 36±1 30±1 55±1 时间/d 10 10 5～7
罐头食品商业无菌的检验
• 二.开罐检查 1.开罐. 注意无菌操作,胖听罐不能点燃灭菌. 2.留样. 以无菌手续取部分内容物于灭菌容器 内,保存于冰箱中,待检验得出结论后可弃去. 3.PH测定. 取样测定PH值,与同批中正常罐相 比,看是否有显著的差异. 4. 感官检查.从产品的外观,色泽,状态,和气味 进行观察和嗅闻,鉴别食品有无腐败变质的迹象. 5.涂片染色镜检.与同批正常样品进行对比,判 断是否有明显的微生物增殖现象.
菌落总数测定
菌落计数 选取菌落数在30—300之间的平板作为菌落总 数测定标准.一个稀释度使用两个平板,应采用 两个平板平均数. 菌落数的报告 菌落数在100以内时,按其实有数报告;大于100 时,采用两位有效数字,在两位有效数字后面的 数值,以四舍五入方法计算.为了缩短数字后面 的零数,也可以用10的指数来表示.
菌落总数测定
• cfu：colony-forming units 菌落形成单 位，一个细菌在平板计数琼脂培养基上 生长形成肉眼可见 选择2—3个适宜稀释度,各取1ml分别加入灭菌平皿内 每皿内加入适量营养琼脂,36℃±1℃培养48h±2h 菌落计数
大肠菌群测定
检验方法
证实实验. 在伊红美蓝琼脂平板上挑取1～2个 可疑菌落进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵 管36±1℃培养24±2h,观察产气情况. 凡乳糖 管产气,革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可 报告为大肠菌群阳性. 报告. 根据证实为大肠菌群阳性的管数,查 MPN检索表,报告每100ml(g)样品中大肠菌群 的最可能数.
检样 稀释 乳糖胆盐发酵管
不产气
产气 伊红美蓝琼脂平板 乳糖发酵管 不产气 阴性
阴性
革兰氏染色
大 肠 菌 群 测 定
革兰氏阳性
阴性
革兰氏阴性 无芽孢杆菌 阳性
产气
大肠菌群测定
检验注意事项 检验步序(乳糖发酵实验,分离培养,证实 实验). 第一步乳糖发酵实验是样品的发 酵结果,不是纯菌的发酵实验,所以初发酵 阳性管经平板分离和证实实验后,有可能 成为阴性.如果平板上典型菌落甚少或者 不够典型,则应多挑菌落做证实试验以免 出现假阴性.
整个操作过程都要在 无菌状态下进行
报告
菌落总数测定
测定过程中的一些要求和规定 (一) 所用器皿和稀释液 检验中所用器皿必须是完全灭菌的,在灭菌前 应洗刷干净,不得残留抑菌物质. 用作样品稀释的液体,每批都要有空白对照. 检样的稀释液可以用灭菌生理盐水或蒸馏水, 最好使用磷酸缓冲液.
菌落总数测定
罐头食品商业无菌的检验
• 术语和定义 4. 泄漏 罐头密封结构有缺陷,或由于撞击而 破坏密封,或罐壁腐蚀而穿孔致使微生物侵入 的现象. 5. 低酸性罐头食品 除酒精饮料以外,凡杀菌 后平衡PH值大于4.6,水活性值大于0.85的罐头 食品. 6. 酸性罐头食品 杀菌后平衡PH值等于或小 于4.6的罐头食品.
免混淆,可做一检样稀释液与琼脂混合的平皿,不经培
养,而于4℃环境中放置,以便在计数时做对照. 为了防止检样中食品颗粒与菌落混淆,也可在已溶化而