■通信作者　E mail :baxiaoge1957@yahoo .com .cn绿色荧光蛋白GFP 的研究进展及应用吴沛桥1,巴晓革2■,胡海1,赵静1(1.南京农业大学生命科学学院,南京210095;2.山东药品食品职业学院,威海264210)摘要:源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP ),是一种极具应用潜力的标记物,有着极其广泛的应用前景。

我们就GFP 的理化性质、荧光特性、改进和应用研究进行了综述。

关键词:绿色荧光蛋白(GFP );标记物;荧光特性;进展;改进;应用中图分类号:Q51,503;R318 文献标识码:A 文章编号:1672-6278(2009)01-0083-04Research Progress and Application of Green Fluorescent ProteinWU Peiqiao 1,BA Xiaoge 2,HU Hai 1,ZHAO Jing1(1.Nanjing Agricultu ral University ,College of Life Science ,Nanj ing 210095,China ;2.Shandong Drug and Food V ocatio nal College ,W eihai 264210,China )A bstract :The green fluorescent protein (GFP )from the jellyfish Aequorea vietoria is a great potential for application of the marker ,has a wide range of applications .The article on the physical and chemical properties ,the fluorescence characteristics ,improvement and application of GFP are reviewed .Key words :Green fluorescent protein ;Marker ;Fluorescence characteristics ;Progress ;Improvement ;Application1　引　言发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象,一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光,而栉水母类发射蓝色荧光。

绿色荧光蛋白(Green fluorescent pr otein ,GFP )是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。

1962年Shimomura 等[1]首先从多管水母(Ae quoria victoria )中分离出一种分子量为20kD 的称为A equorin 的蛋白。

由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色,因此,人们将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。

随后,人们从不同动物体内提取出了各种不同的GFP ,其中研究较为深入的是来自多管水母科(Aequorleidae )和海紫罗兰科(Renillidae )的GFP ,即Ae quoria GFP 和Renilla GFP 。

2　GFP 的理化性质,荧光特性及其改进2.1　GFP 的理化性质从水母体内分离到的GFP 基因,长达2.6kD ,由3个外显子组成,分别编码69、98和71个氨基酸。

GFP 本身是一种酸性,球状,可溶性天然荧光蛋白。

A equoria GFP 分子量约27×103,一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽;而Renilla GFP 是分子量为54kD 的同型二聚体。

两种GFP 有不同的激发光谱,A equoria GFP 在395nm 具有最高光吸收峰,肩峰为473nm ;Renilla GFP 在498nm 具有强烈的光吸收,肩峰为470nm 。

两种GFP 含有相同的生色团,发射光谱基本相同(λmax =508～509nm )。

GFP 性质极其稳定,易耐受高温处理,甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。

其变性需在90℃或pH <4.0或pH >12.0的条件下用6mol L 盐酸胍处理,一旦恢复中性环境,或去除变性剂,虽然变性的蛋白质并不能完全复性,但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH 变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。

更重要的是,它们在很大的pH 范围内(pH7～12.2)的吸收、发射光谱也是相同的。

Renilla GFP 的稳定性就更为显著。

它在上述一系列的变性条件下都很稳定,不易变性。

根据Sheen生物医学工程研究J ournal of Biomedical Engineering Res earch2009,28(1):83～86 等[2]的研究,GFP在受体内表达时,其稳定性并不亚于CAT蛋白,因而可以得到持续时间较长的荧光。

2.2　GFP的荧光原理GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。

GFP表达后折叠,在氧存在的条件下,使66位氨基酸残基的α、β键间脱氢。

由65～67位的氨基酸残基(Ser-Tyr-Gly)环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮(4-p-hydroxybene -5-imidazolinone),形成生色团(基于组成生色团的元件不同,可将已知的GFP及其变种分为7种,每一种都有一组不同的荧光激发和发射波长)[3-5]。

GFP无需再加任何底物和辅助因子,在紫外或蓝光激发下就能发荧光,在450～490nm蓝光激发下, GFP荧光至少能保持10min以上,不像其他荧光素,荧光容易淬灭。

其中,GFP的一个引人注目的特点,其生色团的形成没有物种的特异性,可以在翻译后2～4h通过自动催化作用来合成。

Cubitt等[6]认为生色团自身环化的驱动力来自蛋白质三维结构的形成,由此Kolb等[7]提出一个假说,即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行。

2.3　GFP的荧光性质及应用优点[8-9]GFP的荧光性质比较特殊,具有诸多优点而备受关注。

(1)易于检测,灵敏度高。

GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子,只需紫外光或蓝光激发,即可发出绿色荧光,用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到。

其次,即便是未经纯化的GFP发射的绿光也是相当强的,在正常室内光线下仍清晰可辨。

对于单细胞水平的表达也可识别。

(2)荧光性质稳定。

GFP对光漂白(一种荧光衰减现象)有较强的耐受性,能耐受长时间的光照,从而延长了可探测时间;GFP在pH7～12范围内也能正常发光,对高温(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。

(3)对细胞无毒害。

从目前的研究结果来看, GFP对生活的细胞基本无毒害,与目的基因融合后,对目的基因的结构功能没有影响,转化后细胞仍可连续传代。

(4)构建载体方便。

由于编码GFP的基因序列很短,所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒,而不至于使质粒过大影响转化频率。

(5)可直接用于活细胞测定。

GFP是能在异源细胞内表达后,能自发产生荧光的蛋白,并且GFP 的分子量较小,N-端和C-端都能忍受蛋白的融合,是理想的标记物,可进行活细胞实时定位观察,更能接近自然真实的状态。

如在活细胞中直接观察蛋白向细胞核、内质网运动的状态,还可实时观察到外界信号刺激下,目的蛋白的变化过程,借助荧光显微镜观察,使研究更为方便。

使用激光共聚焦显微镜,其图像效果更佳,结合现代的计算机软件,可进行三维显示。

(6)不受假阳性干扰。

由于其他生物本身不含有GFP,因此不会出现假阳性结果,GFP作为分子探针可以代替荧光染料,避免由于染料扩散造成的定位不准,使结果真实可靠。

(7)广谱性。

表现在GFP的表达几乎不受种属范围的限制,在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达,其次是GFP没有细胞种类和位置上的限制,在各个部位都可以表达发出荧光。

(8)易于得到突变体。

如GFP中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体,且增强了荧光强度,适合在不同物种中专性表达。

2.4　GFP的改进尽管GFP作为报告基因或分子探针有许多无可比拟的优点,但是野生型GFP(wtGFP)具有一定的缺点:如GFP有两个激发峰影响了其特异性,并且长波激发峰强度较小,不易观察;GFP合成及折叠产生荧光的过程慢,蛋白质折叠受温度影响大,表达量较低;而且在某些植物细胞中并不表达。

这些都限制了进一步的应用,所以,一些研究人员运用定点突变、DNA-shuffling等技术对GFP进行了改进,获得了荧光光谱、量子产率、溶解性、密码子嗜性、温度敏感性等改变的多种突变体,扩大了GFP的应用范围。

2.5　GFP的改进方法2.5.1　除去GFP基因中隐蔽型内含子　Haseloff 等[10]利用农杆菌把含花椰菜花叶病毒35S启动子驱动的GFPcDNA转入到拟南芥上,但在转基因拟南芥幼苗上检测不到GFP的荧光。

经研究发现这是由于GFP片段中第405～488碱基序列转录的mRNA被植物误识别为内含子,从而被错误加工,导致GFP不能正确表达。

因此改变碱基组分,消除隐蔽型内含子,可以避免植物细胞的错误剪接。

如突变型m GFP改变了碱基组分后,在转基因拟南芥中检测到荧光,但荧光强度较弱。

2.5.2　消除编码蛋白的积累　Haseloff等[10]认为消除隐蔽型内含子后的突变体mGFP荧光较弱,可能是由于编码蛋白的积聚。

增加ER定位信号可部分84 生物医学工程研究 第28卷消除编码蛋白的积累,增加荧光强度。

2.5.3　改变碱基组分　Zolotukhin等[11]改变了wt G FP基因编码区中88个密码子中的92个碱基而用人类基因组中常用的密码子代替,使GFP的荧光强度提高22倍。

其中S65T突变提高了GFP的荧光强度,Y66H突变使之同时具有部分蓝色荧光蛋白(B FP)的性能,但其蓝色荧光强度很低。

这种GFPh 是一种人工全合成的适合在哺乳动物细胞中高效表达GFP的突变体。

McCullough等[12]对水母的密码子进行优化修饰,更换为植物偏爱密码子,即增加G 和C的含量,降低A和T含量,改造的GFP基因表达效率可有较大提高。

2.5.4　更换GFP生色团氨基酸　Heim等[4]将wt G FP中的Ser65用Thr替代,得到突变体S65T-GFP,相比wtGFP具有明显的改进。

首先,S65T-GFP激发谱中只有一个峰,且红移至490nm,是一种红移荧光蛋白(RSFP)。

用蓝光即可激发R SFP,更适于普通荧光显微镜观察。

其次,激发后产生的荧光强度是wtGFP的6倍,并且对光漂白具有更强的抵抗性。

最后,这种突变体分子的成熟速度比wtGFP 快4倍,从而缩短了从合成到发光的时间。