口蹄疫实验室诊断
口蹄疫实验室诊断
1、国家和行业标准： 口蹄疫诊断技术 GB/T 18935-2003 2、目前无行业标准。




一、病原学检测 （一）微量补体结合试验 （二)查毒试验 (三）反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术 （四）病毒中和试验（VN） （五）反向间接血凝试验 二、血清学检测 （一）病毒感染相关（VIA）抗原琼脂凝胶免 疫扩散试验（VIA-AGID） （二） FMD正向间接血凝试验 （三）3ABC非结构蛋白抗体ELISA （四）液相阻断-酶联免疫吸附试验（LpBELISA）
（二）操作程序


1、总RNA萃取
（1） 用1.5ml带盖塑料离心管。取300μ l待检样品， 再加300μ l变性液混匀，冰水浴5min。 （2）加60μ l 2mol/L乙酸钠（pH4.0），混匀。 （ 3 ）加 800 μ l 酚三氯甲烷 - 异戊醇混和液，混匀，冰 水浴5min。 （4）8000r/min离心10min。将上清液转入另一洁净管。 （5）加800μ l异丙醇。混匀后置-80℃1h，或-30℃4h 以上（或过夜）。 （ 6 ） 12000r/min。离心 10min。尽量倒干液体，留下 RNA沉淀。
3、专用仪器设备 台式高速（12000r/min）离心机；DNA 扩增仪；稳压移流电泳仪和水平电泳槽； 电泳凝胶成相分析系统（或紫外透射 仪）；可调移液器一套，包括1μl~20μl 2 支，20μl~200μl 1支，200μl~1000μl 1支； 与移液器匹配的滴头；1.5ml带盖塑料离 心管（Eppendorf管）；0.5ml或0.2ml（与 扩增仪配套）带盖塑料管。
3、PCR扩增 反应液总量50μ l。试验开始，首先将反 转录产物转入PCR专用小塑料管中。然后 如下操作： a）模板：反转录产物20μ l。 b） 引 物 ： VP1A（12.5pol/μ l）2μ l， VP1B（12.5pmol/μ l）2μ l. c）DEPC-ddH2O：18.5μ l。 高速离心10s。沸水浴5min，转入冰水中 骤冷。然后再加：


１、用 pH7.2 0.1mol/L PBS（生理盐水）洗 ２－３次，并用消毒滤纸吸取水份。 ２、称重，加少许玻璃砂研磨，制成１：３悬 液，室温浸毒１小时或４℃冰箱中过夜。 ３、3000-4000转/分钟离心20分钟，收集上清 液。 4、58℃水浴箱中灭能40分钟（或不灭能）。 5、3000-4000转/分钟20分钟，收集上清即为 待检抗原，置4℃冰箱备用。
A.1.2 牛、羊食道-咽部分泌物 （O-P液）样品
A.1.2.1 样品的采集 被检动物在采样前禁食（可饮水） 12h，以免 反刍胃内容物严重污染 O-P 液。采样用的特制 探杯（ probang cup）在使用前经 0.2% 柠檬酸 或2%氢氧化钠浸泡，再用自来水冲洗。每采完 一头动物，控杯都要重复进行消毒和清洗。采 样时动物站立保定，操作者左手打开牛口腔， 右手握探杯，随吞咽动作将反刍胃内容物严重 污染，要用生理盐水或自来水冲洗口腔后重新 采样。
一、病原学检测
(三）反转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 技术 （五）反向间接血凝试验

(三）反转录-聚合酶链反应 （RT-PCR）技术
（一）材料 1、样品的采集和处理； 2、试验 ；3、 专用仪器设备 ；4、电泳缓冲液 （二）操作程序 1、总RNA萃取 ；2、反转录 ；3、PCR 扩增 （三）结果分析和判定 1、1%琼脂糖凝胶板的制备 ；2、加样 ； 3、电泳 ；4、结果观察和判定

（一）材料
1、样品的采集和处理 （1）样品的采集，保存和运送方法见附录A。 （2）处理：在无菌室内将采集的动物组织， 如淋巴结、脊髓、肌肉等除去被膜及其他结缔 组织，尽量选取中心洁净的部分。依据检测试 验的要求，将各种组织分别剪碎，用研体加灭 菌石英砂磨碎；或将组织样品分组合成大样， 用组织捣碎机磨碎。多面手加 0.04mol/L PBS （pH7.4）制成1:5悬液。置室温（20℃左右） 2 h 以 上 ， 或 4 ℃ 冰 箱 过 夜 。 3 0 0 0 r/min 离 心 10min，取上清液作为检测材料。 （3）阳性对照：以已知病毒材料，如FMDV 感染乳鼠或细胞为阳性对照。与待检病料同时 萃取总RNA，再反转录-PCR扩增。其扩增产物











4、电泳缓冲液 （1）5×TBE缓冲液 三羟甲氨基甲烷（Tris） 54.0g 硼酸 27.5g 0.5mol/L 乙 二 胺 四 乙 酸 （ EDTA）（pH8.0） 20.0ml 加双蒸水（ddH2O）至 1000.0ml （2）1×TBE（电泳缓冲液） 临用时将5×TBE缓冲液1份加蒸馏水4份，混匀 即可。 （3） 电泳加样缓冲液 溴酚蓝 0.25g 甘油 30.0ml 双蒸水 70.0ml

A.1.2.2 样品的保存 在采样现场将采集到的8ml~10ml O-P液 倒入容易25ml以上，事先加有8ml~10ml 细胞培养维持液，或0.04mol/L PB，（ pH7.4）的灭菌窗口如广口瓶，细胞培养 瓶或大试管中。加盖翻口胶塞后充分摇 匀。贴上防水标签，并写明样品编号、 采集地点、动物种类、时间等，尽快放 入装有冰块的冷藏箱内。然后转往-60℃ 冰箱保存。

（三）结果分析和判定
1、1%琼脂糖凝胶板的制备 称取1g琼脂糖，加入100ml 1×TBE缓冲 液中。加热融化后加5μ l（10mg/ml）溴 乙锭，混匀后倒入放置在水平台面上的 凝胶盘中，胶板厚5mm左右。依据样品数 选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔 出梳子（胶中形成加样孔），放入电泳 槽中，加1×TBE缓冲液淹没胶面。

附录A 水泡性疾病诊断样品的采集、 保存和运送
A.1 样品的采集和保存 A.1.1组织样品 A.1.2 牛、羊食道 - 咽部分泌物（ O-P 液） 样品 A.1.3 血清 A2 样品的运送

A.1.1组织样品
A.1.1.1 样品的选择 用于病毒分离、鉴定的样品以发病动物 （牛、羊或猪）未破裂的舌面或蹄部、 鼻镜、乳头等部位的水泡皮和水泡液最 好。对临床健康但怀疑带毒的动物可在 屠宰后采集组织样品如淋巴结、脊髓、 肌肉等作为检测材料。

d）10×PCR缓冲液：3μ l。 e）底物dNTP（2.5mmol/μ l）：4μ l。 f）TaqDNA 聚合酶（ 5U/μ l）：0.5μ l（ 高速离心10s，或不离心）。 g）矿物油：40μ l。 高速离心10s。 将反应管插入扩增仪中，指令设定程序 开始工作。30个循环。 每个循环包括：变性94℃ 1min，退火 55℃ 1min，聚合72℃ 1.5min。最后一个 循环的聚合延长为10min。




j）dNTP： 包 括 1 0 0 mmol/L 脱 氧 腺 苷 三 磷 酸 （dATP）、胞苷三磷酸（dTTP）、脱氧胞苷三 磷酸（ dCTP）、脱氧三磷酸乌苷 dGTP 各 1 支。 用DEPC-ddH2O配制成2.5mmol/L dNTP，方法是 4 种脱氧核苷酸各取 10 μ l，加入 360 μ l DEPC 双蒸水中，混匀即可。 k）无水乙醇：用（焦碳酸二乙酯）DEPC-ddH2O 配制成75%乙醇。 l）DEPC：一种RNA酶的强烈抑制剂。按0.1%含 量加入蒸馏水（ DEPC-ddH2O），作为 RT-PCR 反 应用试剂。也用于浸泡移液器尖头，塑料管等 接触 RNA 的试验器材，以减少试验过程中萃取 RNA的失活和断裂。 m）矿物油。 n）引物：架上摆一排试管 8 支，自第 1 管开始由左至右用稀释液进行对倍 稀释（即 1 ： 6 ； 1 ： 12 ， 1 ： 24…….1 ： 768 ）， 每管体积0.5毫升即可。 2、在有机玻璃板（1350,96孔）上进行如下操 作：

（ 1 ）滴加待检抗原：在 1-5 排每排的第 8 孔滴 加试管架第8管稀释抗原50ul, 每排的第7孔滴 加试管架第 7 管稀释抗原 50ul, 以此类推至第 1 孔；每排的第 9 孔滴加稀释液 50ul，作为阴性 对照；每排的第 10 孔按顺序分别滴加 A、O、C 、AsiaⅠ口蹄疫和水疱病 5 种标准抗原各 50ul ，作为阳性对照（注意换滴头）。 （ 2 ）滴加红细胞诊断液：用前将红细胞诊断 液摇匀，于反应板1-5排孔分别滴加A、O、C、 AsiaⅠ口蹄疫和水疱病诊断液25ul，在振荡器 上振荡后，室温放置1.5-2小时后判定结果。

2、加样 取6μ l~8μ l PCR扩增产物和2μ l~3μ l 加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每 次电泳至少加1孔阳性对照的扩增产物为 对照。

3、电泳 电压80V~100V，或电流40mA~50mA， 电泳30min~40min。

4、结果观察和判定 电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射 仪上打开紫外灯观察，如某一待检样品 扩增产物的DNA带与阳性对照的带在一条 直线上，即它们与加样孔的距离相同， 则该样品判定为阳性。

（五）反向间接血凝试验
（一）诊断试剂 （二）病料的采集与运输（见附录Ａ） （三）病料的处理 （四）试验步骤 （五）结果判定 （六）诊断液的保存及活力检查

（一）诊断试剂
1 、 A、O、C、AsiaⅠ口蹄疫和水疱病标 准抗原和诊断液。 2、稀释液。

（三）病料的处理


A.1.3 血清

无菌操作采集动物血，每头不少于10ml 。自然凝固后无菌分离血清装入灭菌小 瓶中，可加适量抗菌素，加盖密封后冷 藏保存。每瓶贴标签并写明样品编号、 采集地点、动物种类、时间等。
A2 样品的运送
将封装和贴上标签，已预冷或预冰冻的样品装 入冰瓶或保温泡沫塑料盒内，同时加放 -30℃ 预冰冻的保冷剂和适当的填充材料，再加盖密 封。包装盒上注明“小心!!易碎易变质生物材 料，途中不许打开；无商业价值。”以最快方 式，派专人送到或航寄到农业部指定的单位。 样品需写明送样单位名称和联系人姓名、联系 地址、邮编、电话及电话号码等。 送检材料应附有详细说明，包括采样时间、地 点、动物种类、样品名称、数量、保存方式及 有关疫病发生流行情况和临床症状等。