乙型肝炎病毒基因分型方法简述邵 玲 张 男【摘要】乙型肝炎病毒是一种嗜肝脱氧核糖核酸病毒,属于一种复合体DNA病毒。
乙型肝炎病毒可按两种方法分型:血清型和基因型。
随着分子生物学的发展以及对乙型肝炎病毒研究的深入,乙型肝炎病毒血清分型法已不能适应对该病毒感染研究的需要,而出现的基因分型法则引起广泛的重视。
【关键词】乙型肝炎病毒;基因分型方法H epatitis B virus gene minute method summ aryS HA O L in Z HA N G N an【Abstract】The hepatitis B virus is one kind is addicted to the liver deoxyribonucleic acid virus,belongs to one kind of complex DNA virus.The hepatitis B virus may according to two method minutes:Blood serum and genotype.Along with molecular biology’s development as well as to hepatitis B virus research’s thorough,a hepatitis B virus blood serum minute law has not been able to adapt to this virus infection research need,but appears a gene minute principle brings to the widespread attention.【K ey w ords】Hepatitis B virus;Gene minute method 乙型肝炎病毒是一种嗜肝脱氧核糖核酸病毒,属于一种复合体DNA病毒。
乙型肝炎病毒可按两种方法分型:血清型和基因型。
随着分子生物学的发展以及对乙型肝炎病毒研究的深入,乙型肝炎病毒血清分型法已不能适应对该病毒感染研究的需要,而出现的基因分型法则引起广泛的重视。
1988年Ok2 mamoto[1]对18株不同亚型的HBV基因序列两两进行比较后,根据核苷酸序列异源性>8%的原则,将18株HBV DNA序列分为A～D4个基因型,提出了HBV基因型的概念。
1992年Norder[2]发现ayw4和adw4q-两旧亚型之间及基因型A～D 之间S基因差异>4%,提出了两种新的基因型E,F,1994年Norder通过全基因序列P3测定加以证实。
2000年Stuyver[3],在研究来自法国和美国的慢性乙肝病人血清样本时,发现有13株病毒无法归入A～F型,命名为G型。
随后,日本和德国也相继发现了G基因型。
2002年Arauz～Ruiz[4]对10株HBV进行基因型研究,发现其中3株虽与F型相近,但与F型又有明显的不同,进而命名为H型。
截止现今,HBV基因型可分为A～H八型。
目前,国内外对HBV进行基因分型主要有“基因序列测定法、聚合酶链反应———限制性片段长度多态性分析法、基因型特异性表位单克隆抗体的EL ISA、基因型特异性线形探针检测法、基因型特异性引物PCR法和基因芯片技术”。
1 基因分型原理1.1 全基因序列测定。
全基因序列测定是根据HBV所有病毒核苷酸异源性>8%进行分型的。
Okamoto对从日本及印度尼西亚adw2慢性携带者中分离出的3株HBV进行全序列测序及比较,其核苷酸的异质性为3.9%～5.6%,而与美国2株相同血清亚型HBV序列比较,异质性达8.3%～9.3%,达到甚至超过不同血清亚型HBV的异质性,从而说明血清学分型不能真正反映HBV基因变异。
再经对18株HBV DNA进行两两比较分析,根据同源性<92%、异质性>8%,将其分为A, B,C及D4个基因型,初步建立了基因分型体系。
12年后Stuyver使用该方法,发现了一种新的3248bp的HBV基因型G 。
1.2 S基因序列测定。
由于乙型肝炎病毒基因可分为p基因、前s基因、编码HBs4的s基因、C基因及X基因(如图),可分别对它们进行研究,从而找出各个基因型在各个基因之间的差异。
Nor2der[5]对32例HBV患者s基因测序结果进行分析,并建立进化树,基因型间异质性>4%。
除证实了Okamoto的A～D分型外,还发现了2个新的基因型E和F,使HBV基因型达到6个(A～F)。
在其后对28例HBV全基因组、p基因、前s基因、编码HBs4的s基因、C 基因及X基因分别比较并建立进化树,进一步证实根据s基因序列分型最接近全基因组,从而证明了单独使用S基因进行分型的可靠性。
目前,此法尚在使用,主要有SSP和SSO[6],即基因型特异性引物PCR法和基因型特异性线形探针检测法。
2 基因分型方法2.1 序列测定法。
即直接测定核苷酸序列,根据差异分型。
自Okamoto据HBV基因型之间的全序列异质性8%进行分型以来,测序由于方法直接、可靠而成为主要鉴定HBV基因型的方法。
同全序列进化树图比较,发现S基因的序列变化同全基因序列的变化一致,可用S基因序列代替全基因序列进行分型,界限为核昔酸序列的异质性4.0%。
该法虽较为可靠但操作繁琐、费用昂贵,不适于临床大量标本检测。
2.2 聚合酶链反应———限制性片段长度多态性分析法(PCR～RFL P)。
目前常用的基因分型方法,通过PCR扩增出目标基因片段(通常为S基因或Pres/s基因),用特定的限制性内切酶进行酶切,根据酶切图谱进行基因分型。
Mizokami[7]通过分子进化方法对已知基因型的68例HBV患者全基因、106例HBV患者s基因序列进行分析,发现并确认基因型特异性酶切位点区域。
Lindh[8]对不同基因型S基因的特异酶切位点进行分析,设计使用限制性内切酶Trp509I和Hinf I使S基因PCR产物产生不同长度的酶切片段,成功地将166/180例患者HBV实现A-F基因分型。
RFL P敏感性高,但酶切位点易受基因变异影响,且遇混合感染或酶切不完全,会出现复杂条带,影响分型结果判断。
2.3 基因型特异性表位单克隆抗体的酶联免疫吸附法(EL ISA)PreS2多肽有多组抗原表位。
基因型不同抗原表位也不同,从而可以鉴定不同基因型。
Usuda[9]等用此法制备前S2区域基因型特异性表位的单克隆抗体,并用辣根过氧化酶进行标记,对68例HBV阳性患者血清检测,分型结果与S基因测序分型完全一致。
在后期实验中发现,适用于大规模的流行病学调查,使较大范围的HBV的研究成为可能。
2.4 基因型特异性线形探针检测法。
该方法是设计型特异的探针,检测HBV扩增产物,以产物的不同长度或与探针的反应性来区分不同型别。
Kato[10]利用G基因型的病毒在核心区有36个核苷酸的插入,设计引物用PCR的方法可以对G基因型进行特异的筛查。
早在1983年Wu用酶切的方法研究血清型的酶切图谱,来区分不同的血清型。
王虹[11]等采用PCR2核酸杂交/EL ISA检测,主要是联合利用PCR、核酸杂交和酶联免疫技术,设计前C和C区的探针,可以快速准确的区分HBV的基因型。
另外Van G eyt[12]根据A～F基因型的保守序列设计了18种型特异性探针与HBV S (下转12页)腹和餐前为阴性。
故临床送检时要注明采集时间。
在糖尿病肾病时由于肾小球硬化,使肾小球滤过率和肾小管对糖的重吸收下降,肾糖阈升高,此时即使血糖很高但尿糖可为阴性。
不能以此作为病情控制的指标。
老年人可以出现肾糖阈升高,妊娠及肾性糖尿病可以出现肾糖阈降低,前列腺肥大或膀胱疾病等造成残余尿增多,尿糖均不能反映血糖水平。
对肾糖阈正常时,尿糖结果可以作为糖尿病诊疗的参考。
维生素C 是糖尿病病人的常用药物。
但可使尿糖出现假阴性。
为了不影响糖尿病病人的正常治疗,在化验血糖、尿糖前2～3d ,应停用维生素C ,这样就可以消除其对化验结果的影响。
同样道理,在化验前1～2d ,最好也不要大量食用富含维生素C 的蔬菜和果。
如菠菜、柿子椒等深色蔬菜和花菜,以及柑橘、红果、柚子等。
野生的苋菜、苜蓿、刺梨、沙棘、猕猴桃、酸枣等含维生素C 量颇丰,也应注意停止食用。
3 尿液酮体的检测应注意的问题①对于重症糖尿病酮症患者,尿酮体检验对病情判断及治疗都很重要,为保证检验结果的准确可靠应充分了解以下酮体检测的影响因素:尿酮体中的丙酮和乙酰乙酸都具有挥发性,乙酰乙酸更易受热分解成丙酮,易导致强阳性标本的反应减弱;②尿液标本被细菌污染后,酮体消失,易导致假阴性,因此,尿液标本必须新鲜,及时送检;③糖尿病酮症酸中毒早期病例中,主要酮体成分是β-羟丁酸,很少或缺乏乙酰乙酸。
仪器专用试纸仅与酮体中的乙酰乙酸和丙酮发生反应(不与占酮体绝大部分的β-羟丁酸反应),产生紫色颜色,根据颜色的深浅判断阳性的强弱。
对乙酰乙酸的敏感性是对丙酮敏感性的7倍左右。
此时测得结果可导致对总酮体量估计不足;④糖尿病酮症酸中毒症状缓解之后,β-羟丁酸转变为乙酰乙酸,反而使乙酰乙酸含量比初始急性期增高,易对病情估计过重;⑤糖尿病酮症酸中毒者肾功能严重损伤而肾阈值增高时,尿酮体亦可减少,甚至完全消失,易导致假阴性;⑥服用双胍类降糖药:如降糖灵等,由于药物有抑制细胞呼吸作用,可出现血糖已降,但尿酮阳性的现象。
⑦缺氧时,较多的已酰乙酸被还原为β-羟丁酸,尿液酮体反而减弱。
参考文献[1] 杨克勒.脊柱疾患的临床与研究[M ].北京出版社.1993:653-654[2] 刘尚礼.对腰椎后路椎间盘镜技术的一些看法[J ].中华骨科杂志,2004,24(2):90[3] 靳安民,陈仲,邵振海等.腰椎间盘突出症三术式远期疗效的比较[J ].中华骨科杂志,2003,18(2):711-714作者单位:511450 广东省广州市番禺区石碁人民医院(上接8页) 基因的PCR 产物杂交而实现分型。
Stuyver [13]使用该方法对来自法国里昂的36份、来自美国亚特兰大的82份HBV 阳性血清分型。
此法检测时需要的PCR 产物量较多,费用较高。
2.5 基因型特异性引物PCR 法。
该方法是设计型特异的引物,检测HBV 扩增产物,以产物的不同长度或与探针的反应性来区分不同型别。
Naito [14]根据A ～F 基因型中特异性的保守序列设计引物并进行套式PCR ,将HBV 进行A ～F 分型。
另外,可根据C 基因、前S 基因长度多态性以及HBV 特定部位上与基因型密切相关的核苷酸而确定。
此法需要进行多管PCR ,费用也较高。
2.6 基因芯片技术。
基因芯片,又称基因微矩阵,其原理[15]是将大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序地和高密度地排列固定于玻璃或硅等载体上,然后与待测的有荧光标记的样品核酸按碱基配对的原则进行杂交,通过激光共聚焦系统检测杂交信号强度,经计算机分析处理数据资料,获取样品分子的数量和序列信息,从而可对核酸序列进行大规模、高通量的研究。