电子穿透薄切片，然后经电磁“透镜” 电子穿透薄切片，然后经电磁“透镜”细胞内部的超微结构 放大 电子射到样品表面发射出更多的二次 样品的表面形态 电子， 电子，放大 落射式光源通过物镜投射于样品上， 落射式光源通过物镜投射于样品上， 细胞中的某些物质 经紫外线照射发出荧光 （叶绿素、微管等） 叶绿素、微管等） 用激光作扫描光源，逐点、逐行、 用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐 面快速扫描成像 ，扫描的激光与荧 光收集共用一个物镜， 光收集共用一个物镜，物镜的焦点即 扫描激光的聚焦点 观察细胞形态 细胞内生化成分的定量分 析、光密度统计以及细胞 形态的测量
测序仪、 测序仪、扫描仪
凝胶图像分析系统、核酸蛋白检测仪、光密度扫描仪、 凝胶图像分析系统、核酸蛋白检测仪、光密度扫描仪、 激光扫描仪、 激光扫描仪、荧光显微镜
分光光度计、荧光分光光度计、 分光光度计、荧光分光光度计、扫描酶标仪
利用近红外光谱的代谢功能测量
如图所示，血红蛋白被氧化的状态 与脱氧化的状态(deoxy-Hb)的吸收光 如图所示，血红蛋白被氧化的状态(oxy-Hb)与脱氧化的状态 与脱氧化的状态 的吸收光 谱具有微妙差别。 范围氧化血红蛋白的吸收小而呈鲜红色， 谱具有微妙差别。在600～800nm范围氧化血红蛋白的吸收小而呈鲜红色，而在 ～ 范围氧化血红蛋白的吸收小而呈鲜红色 800nm以上脱氧化血红蛋白的吸收小，从测量它们各自吸收率的不同可以知道 以上脱氧化血红蛋白的吸收小， 以上脱氧化血红蛋白的吸收小 组织的氧化程度。 组织的氧化程度。
主要特性
单色性：利于激发光与发射光的分离 单色性： 方向性： 方向性：能量集中 高亮度、大强度：利于激发出荧光， 高亮度、大强度：利于激发出荧光，可缩短扫描时间 相干性和偏振性
1. Lacrimal gland endpiece 2. Convallaria (lily of the valley) stalk 3. Rat brain – cortex 4. Cultured hepatocytes 5. Rat brain – cerebellum 6. Fly salivary gland 7. Human embryonic kidney cells 8. Arterial endothelial cells 9. Polychaete worm (Brania sp.) 10. Drosophila retina 11. Pulmonary artery endothelial cells 12. Hepatocytes 13. Salivary gland from fly larva 14. Volvox alga 15. Plant leaf with guard cells
光学显微镜 经物镜形成倒立实像， 经物镜形成倒立实像， 经目镜放大成虚像
近场光学显微镜
近场光学显微镜与普通光学显微镜基本结构相似， 近场光学显微镜与普通光学显微镜基本结构相似，但前者在离试样表面很 近处存在探头，该探头起着实现超分辨率的关键作用。 近处存在探头，该探头起着实现超分辨率的关键作用。
第五章 生物物理技术
授课教师： 授课教师：解莉楠 副教授 联系方式：新逸夫教学楼224室 联系方式：新逸夫教学楼 室 linanxie@
He-Ne
CO2
激光器
Ar
高压静电场
放射线
显微镜系统及其应用
光谱技术及其应用
X射线衍射技术及其应用 射线衍射技术及其应用
核磁共振技术及其应用
显微镜系统及其应用
激光共聚焦显微镜工作ຫໍສະໝຸດ 理示意图激光共聚焦显微镜（ 激光共聚焦显微镜（laser confocal microscope，Confocal Laser ， Scanning Microscopy，LSM） ，
激光共焦显微镜（ 激光共焦显微镜（laser confocal microscope）的原理图。 ）的原理图。 从点光源（激光） 从点光源（激光）发出的光经过透镜聚光后照射到试样内 的观察点上，此时在试样内形成照射光的斑点， 的观察点上，此时在试样内形成照射光的斑点，利用物镜 通过空间滤波器使这些斑点在检测器上成像。 通过空间滤波器使这些斑点在检测器上成像。 以上用透射型模型说明了其原理， 以上用透射型模型说明了其原理，但 实际上采用反射型结构。 实际上采用反射型结构。
利用外差法的光学CT检测的实验装置 利用外差法的光学 检测的实验装置
光学相干层析术即光学OCT（ 光学相干层析术即光学OCT（optical coherence OCT tomography） tomography）
（ a）光学相干层析术的原理如图所示 ，其基本结构为迈克耳孙干涉仪。 ）光学相干层析术的原理如图所示，其基本结构为迈克耳孙干涉仪。 OCT把光分成两束 把光分成两束——信号光与参考光，其中信号光聚焦后照射到组织 信号光与参考光， 把光分成两束 信号光与参考光 内得到向后散射光， 内得到向后散射光，参考光在压电陶瓷等器件调制的反射镜上反射回来 得到光程调制。两束光进行干涉后用外差探测法检测。 得到光程调制。两束光进行干涉后用外差探测法检测。
X射线晶体学的结果并不是分子的图像，而是分子中电子 射线晶体学的结果并不是分子的图像， 射线晶体学的结果并不是分子的图像 的空间分布，即电子密度图（ ）、电 的空间分布，即电子密度图（electron density map）、电 ）、 子紧密围绕着原子核， 子紧密围绕着原子核，因此电子密度图可以作为分子图像 的一个很好的代表。 的一个很好的代表。
电子显微镜
1
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1:对照花粉雕纹（放大倍数×10 000）；2:激光J2处理花粉雕 纹（放大倍数×10 000）；3:对照花粉管原始体（放大倍数 ×2 000）；4:激光J2处理花粉管原始体（放大倍数×2 000） 草原龙胆花粉粒电镜扫描
各种显微镜原理及观察范围
原 光学显微镜 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 荧光显微镜 激光共聚焦扫描 显微镜 理 可观察到的范围 生物体的器官组织结构或 生物细胞的内部构造 经物镜形成倒立实像， 经物镜形成倒立实像，经目镜放大 成虚像
蛋白质晶体学
1934年，Bernal第一张蛋白质（胃蛋白酶）晶体的 射线 年 第一张蛋白质（ 第一张蛋白质 胃蛋白酶）晶体的X射线 衍射照片。 衍射照片。 50年代后期 Perutz和Kendrew的血红蛋白和肌红蛋白的 50年代后期，Perutz和Kendrew的血红蛋白和肌红蛋白的 年代后期， 低分辨结构（ 低分辨结构（Nobel Price，1962） 。 ， ） 精度、速度、结构生物学。 精度、速度、结构生物学。
相差显微镜
把透过标本的可见光的光程差变成振 未经染色的标本和活细胞 幅差， 幅差，从而提高了各种结构间的对比 度，使各种结构变得清晰可见 的微粒子 聚光镜中央的挡光片使照明光线不直 小至 4-200nm的微粒子 接进人物镜， 接进人物镜，只允许被标本反射和衍 射的光线进入物镜成像
暗视野显微镜
应用
观察
透过生物体（散射介质） 透过生物体（散射介质）中的光示意图
光学计算机断层术即光学CT（ 光学计算机断层术即光学CT（optical computed CT tomography） tomography）
（2）直线传播光的透射光强非常小，因此问题在于如何将这样的信号选择出来 ）直线传播光的透射光强非常小， 进行高灵敏的检测。目前最有效的方法是光外差探测方法。 进行高灵敏的检测。目前最有效的方法是光外差探测方法。 （3）所谓的外差探测法，一般是对两个不同频率的光波（信号波与参考波）进 ）所谓的外差探测法，一般是对两个不同频率的光波（信号波与参考波） 行混合后检测拍频信号的方法。 行混合后检测拍频信号的方法 。 将激光束分为参考光与入射到生物体试样的信 号光。给予参考光一定的频移后与信号光混合， 号光 。 给予参考光一定的频移后与信号光混合 ， 多次散射得到的光与参考光偏 振方向不一致，不会产生拍频信号， 振方向不一致， 不会产生拍频信号 ， 因此检测出的拍频信号是直线传播光与参 考光干涉的结果。利用外差法的光学CT检测的实验装置如下图 检测的实验装置如下图。 考光干涉的结果。利用外差法的光学 检测的实验装置如下图。
射线CT围绕人体旋转小型 射线源， （1）X射线 围绕人体旋转小型 射线源，由检测器阵列测定 射线透 ） 射线 围绕人体旋转小型X射线源 由检测器阵列测定X射线透 射量后进行数字化，再对这些数据以特定的算法（ 算法 算法） 射量后进行数字化 ， 再对这些数据以特定的算法 （ CT算法） 利用计算 机求解后构成断层像（ 机求解后构成断层像（tomography）。 ） 光从A点入射到生物体内 在点B上观察透射光 点入射到生物体内， 上观察透射光， 光从 点入射到生物体内 ， 在点 上观察透射光 ， 此时透射光中包含着 三种不同的光线，一种是受到散射后向任意方向散射的成分； 三种不同的光线，一种是受到散射后向任意方向散射的成分；第二种是 具有较小的散射角且向前传播的成分； 具有较小的散射角且向前传播的成分；第三种是向前透射直线传播的成 为了实现光学CT必须检测出第三种直线传播的透射成分的光 必须检测出第三种直线传播的透射成分的光。 分。为了实现光学 必须检测出第三种直线传播的透射成分的光。
近场光学显微镜（ 近场光学显微镜（a）与通常光学显微镜（b）的示意图 与通常光学显微镜（
激光共聚焦显微镜
P2
照明针孔光栏 P1
激光经放大、 激光经放大、 分光后由物镜 聚焦于焦平面 同时， 上，同时，焦 平面上被激光 扫描的点F 扫描的点F所发 出的一定波长 的荧光通过检 测针孔光栏达 到检测器， 到检测器，并 成像于显示器 上，得到相应 的荧光图象。 的荧光图象。
光敏感性物质NPe6（mono-L-aspartyl chlorine 6） （ 光敏感性物质 ） 的吸收光谱与荧光光谱
X射线衍射技术
X射线、X射线晶体学 射线、
可以观察到的物体的分辨率要受到观察的光的波长的限制 。