微生物发酵产聚谷氨酸工艺研究摘要：谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占有重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。

以枯草芽孢杆菌纳豆亚种为出发菌株，考察不同碳氮源及NaCl 浓度、谷氨酸、种龄、接种量对微生物发酵产γ- 聚谷氨酸的影响，以提高γ- 聚谷氨酸的产量。

方法：该菌菌种活化后，接入种子培养基，于37℃、200 r/min 震荡培养18 h，然后按2 %接种量接入不同发酵培养基进行发酵培养。

γ- 聚谷氨酸分离纯化后，根据其产量筛选最适发酵培养基组成及发酵条件，并对产物进行分析测定。

关键词：γ- 聚谷氨酸；纳豆菌；发酵；优化培养一、材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto），系作者筛选，由本校微生物教研室罗兵教授鉴定确认，于实验室保存。

1.1.2 培养基斜面培养基：大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 7.5 g/L，琼脂20 g/L。

种子培养基：大豆蛋白胨20 g/L，葡萄糖30 g/L，谷氨酸钠25 g/L，NaCl 5 g/L。

液体发酵培养基：大豆蛋白胨30 g/L，葡萄糖40 g/L，谷氨酸钠30 g/L，NaCl15 g/L，K2HPO42.0 g/L，KH2PO4 4.0 g/L，Mg-SO4 0.5 g/L，CaCl2 0.25 g/L 及少量生物素[1]。

以上培养基pH 均为7.0-7.2，在121℃下高压灭菌20 min。

1.1.3 试剂γ-PGA 标准品为Sigma 公司产品；系列葡聚糖标准品（Shodex P-82 standard 标准品，分子量（Mr）分别为5900，11800，22800，47300，112000，212000，404000，788000）为SHOWA DENKO 公司产品；叠氮钠、硫酸钠、蛋白胨、葡萄糖、谷氨酸等均为国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 发酵方法菌种活化：取菌种一环，接于斜面培养基，37℃培养20 h。

种子培养：取一至两环活化菌种接入种子培养基中，37℃、200 r/min 震荡培养18 h。

发酵培养：将上述种子液按2%接种量接入发酵培养基（装液量为40/250 mL），37 ℃、250 r/min 震荡培养48 h，测γ-PGA 的产量。

1.2.2 提取方法发酵液于4 ℃、10000 r/min 离心15 min 去除菌体，取上清液用6 mol/L HCl 将pH 调至2.0-3.0，加入3 倍体积冰无水乙醇搅拌出现絮状沉淀，低温放置4 h 离心得沉淀（粗品）。

然后溶于蒸馏水，用透析袋透析脱盐（除去无机小分子和离子），再经阴离子交换层析进一步提纯，即将透析过的PGA 样品通过分离用的填充柱，然后再用5 mol/L 的NaCl 溶液进行梯度洗脱，含有PGA 的部分真空冷冻干燥得纯品[2]。

1.2.3 分析方法1.2.3.1 生物量的测定以接种前培养基稀释25 倍后为空白对照，将发酵液同样处理后，用分光光度计读取660 nm 处的吸光值OD660。

1.2.3.2 官能团的测定取纯化后的待测样品溶于蒸馏水，分别用双缩脲、茚三酮、α- 萘酚、蒽酮等显色剂进行生化反应，观察反应变化。

1.2.3.3 薄层层析硅胶G 制板（20cm×15cm×0.3cm），展开剂正丁醇:冰醋酸:水为3:1:1，将γ-PGA 溶液点样于硅胶板，用显色剂（无水乙醇:浓硫酸为1:1）喷雾显色。

另取一定量γ-PGA 样品溶于1 ml 蒸馏水，用等量6 mol/L HCl 于密封的水解管中110 ℃水解过夜，水解物用6 mol/L NaOH 中和，然后点样于硅胶板上。

其中展开剂为正丁醇:丙酮:水为12:3:5，展层完毕后自然干燥，用含0.2 %茚三酮的丙酮溶液喷雾显色。

1.2.3.4 γ-PGA 含量的测定首先对发酵液离心，取上清液用氨基酸分析仪测谷氨酸单体的含量，然后对上清液用6 mol/LHCl110 ℃水解12 h，再测定谷氨酸含量，2 次测定的谷氨酸含量之差即为聚谷氨酸含量[3]。

1.2.3.5 γ-PGA 分子量的测定凝胶渗透色谱法（GPC）。

采用Agilent 公司HP1100 型高效液相色谱仪（含G1362A 型自动进样器、G1362A 型示差折光检测器、Chemstations 色谱工作站和GPC 计算软件）；Shodex Ohpak SB-804HQ 色谱柱（8.0 mm×300 mm，Mr 排阻限1,000,000）；流动相为0.1 mol/L Na2SO4 溶液，流速0.5 mL/min，柱温：35℃，进样量20 μL。

将待测样品加流动相温热溶解成一定浓度后，用0.22 μm 微孔滤膜过滤即得。

由保留时间经拟合相对分子量标准方程计算得γ-PGA 相对分子质量。

1.2.3.6 γ-PGA 中D-/L- 谷氨酸组成的测定高效液相色谱法（HPLC）[4]。

1.2.3.7 酶活性的测定首先将上述离心收集的菌体细胞，用质量分数为0.85 %NaCl 溶液洗涤，然后加入0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0，含质量分数分别为1 %、10 %的2- 巯基乙醇和甘油），在4 ℃下超声处理。

谷氨酸消旋酶、D- 氨基酸转氨酶酶活的测定均参照文献[5]进行。

其中酶活单位U 定义为1 min 催化生成1 μmol D- 谷氨酸所需的酶的量（μmol/min），U/mg 表示1 mg 总蛋白中所含的酶活单位。

1.2.3.8 多糖含量的测定将发酵液离心除菌，准确吸取一定量上清液，加蒸馏水定容，然后用苯酚- 硫酸法测定多糖含量[6]。

二、结果与讨论2.1 样品成分分析该菌株发酵产物易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。

官能团测定结果显示该物质没有明显的糖类颜色反应，也没有蛋白质/ 核酸的特征反应，表明其无糖基存在，也没有典型的肽键结构。

将样品水解后茚三酮反应则呈阳性。

经硅胶薄层层析表明，该发酵产物水解前在硅胶板上无显色点，而经酸水解后有一明显的谷氨酸斑点，无其他氨基酸显色点，说明其是由单一的谷氨酸聚合而成，而无其他氨基酸或蛋白质，用高效液相色谱进一步证实。

2.2 γ-PGA 分子量的测定相对分子量标准方程由八个标准葡聚糖在示差检测器上的保留时间计算得，为log（M）=9.6968-0.3182TR，R=0.9994。

其中log（M）表示标准葡聚糖分子量的对数值，TR 表示保留时间（min）。

发酵56 h 时，产物经GPC 测得保留时间为12.781 min，由标准方程计算得其分子量为426 kDa，色谱图见图1。

图1 样品的凝胶渗透色谱图由于γ-PGA 是在多种酶的作用下经过单体的活化作用、消旋作用和聚合作用而形成的，因此没有一个固定的长度，分子量不均一。

由于不同分子量大小的γ-PGA 具有不同的应用，如低分子量可用于药物载体，高分子量用作保水材料、增稠剂、吸附剂等，故测定合成的γ-PGA 的分子量必不可少，以用于进一步研究其应用。

2.3 γ-PGA 发酵条件的优化2.3.1 营养条件对γ-PGA 合成的影响由于到目前为止γ-PGA的合成机制还不明确，以致于发酵菌株及其培养基组成不尽相同，其合成的γ-PGA 分子量和化学结构也差异较大。

但γ-PGA高产菌通常采用合成培养基，碳氮源是生物聚合物形成的必需物，且产量的高低有赖于C-N 平衡和生物量的多少。

2.3.1.1 谷氨酸的影响γ-PGA 产生菌通常可按照其营养要求分为两大类：谷氨酸依赖型和非谷氨酸依赖型。

前者主要有B.anthracis、B.licheniformis ATCC9945A、B.subtilis IFO3335、B.subtilis F-2-01、B.subtilis MR-141 等，需要培养基中加入谷氨酸才能合成γ-PGA；后者有B.licheniformis A35、B.subtilis 5E、B.subtilis TAM-4 等，菌体自身具有较强的谷氨酸合成能力，可将培养基中的碳氮源转化为谷氨酸，然后利用自身的γ-PGA 合成酶系将谷氨酸前体聚合成γ-PGA。

本实验室分离的菌株属前者，且其合成的γ-PGA 经测定由D- 谷氨酸和L- 谷氨酸组成。

这表明在此菌株合成γ-PGA 的过程中存在某种由L- 谷氨酸转变成D- 谷氨酸的途径。

目前由L- 谷氨酸转变成D- 谷氨酸的途径已提出有两种：D- 氨基酸转氨酶参与的非直接转化；谷氨酸消旋酶参与的直接转化。

而在该菌株发酵过程中，转氨酶的活性显著下降（由0.127 降低为0.032 U/mg），消旋酶的活性则一定程度的提高（由0.175 升高为0.380 U/mg），这提示转氨酶可能不参与L- 谷氨酸→D- 谷氨酸。

这与许多γ-PGA 产生菌如B. subtilis(chungkookjang)的转化途径相同。

2.3.1.2 培养基中碳源的种类及浓度的确定发酵培养基中除碳源外其他条件完全相同，分别添加30 g/L 不同种类的碳源，结果如图2 所示。

以葡萄糖为碳源时，γ-PGA 产量最高，且多糖副产物较少，故选葡萄糖为碳源有利于生产高质量的γ-PGA。

且实验表明其浓度为50 g/L 时γ-PGA 产量较高。

图2 不同碳源对γ-PGA 产量的影响(x±s, n=3)2.3.1.3 培养基中氮源的种类及浓度的确定发酵培养基中除氮源外其他条件完全相同，分别添加20 g/L 不同种类的氮源。

可见有机氮源有利于纳豆菌微生物发酵合成γ-PGA，且以酵母膏为氮源时其产量较高，但从经济角度考虑最终选定蛋白胨为氮源。

进一步研究表明40 g/L 为其最适浓度。

2.3.1.4 NaCl 的浓度对γ-PGA 合成的影响发酵液中的NaCl含量过低，在发酵过程中会产生大量泡沫，发酵液的粘度较大，不利于产物的进一步分离纯化；而NaCl 含量过高，会抑制菌体的生长，使γ-PGA 的产量降低，故需优选NaCl 含量。

发酵培养基其他条件不变，分别添加10，20，30，40，50，60，70，80 g/L的NaCl，以考察其对γ-PGA 产量的影响。

NaCl 含量在10-40 g/L 范围内，γ-PGA 的产量随NaCl 含量的增加而增大。

NaCl 含量进一步增加，γ-PGA 的产量反而降低。

虽然NaCl 含量为40 g/L 时γ-PGA 的产量达最大即26.83g/L，但其30 g/L 时γ-PGA 的产量已达26.60 g/L，故从经济角度考虑，NaCl 最适浓度为30 g/L。

2.3.2 培养条件对γ-PGA 合成的影响2.3.2.1 种龄的影响本实验将菌种接入种子培养基中，分别培养9、12、15、18、21、24、27、30 h 后，以2 %接种量接入发酵培养基，测定γ-PGA 产量以确定最佳种龄。