转基因抗虫棉花检测技术规范——定性PCR 筛查方法〔试行〕编制说明为进一步加强对转基因抗虫棉花的安全监管，爱护研发者、经营者和生产者的合法权益，保证人类健康和生态环境安全，依照«农业转基因生物安全治理条例»及其配套治理方法的规定和«关于加强转基因抗虫棉安全治理与监督检查的通知»(农办科[2005] 15号)的要求，满足开展技术检测工作的需要，特制定本技术规范。
1、编制原那么本技术规范的编制遵循以下原那么：(1)法治性：本技术规范的编制，严格执行国家法律法规和强制性标准的规定，以保证国家和研发者、经营者、生产者的权益。
(2)可靠性：本技术规范的编制，力求反应相关领域研究成果的先进性、成熟性和代表性，以保证检测结果的精确性和重复性。
(3)有用性：本技术规范的编制，力求把经济有用和技术有用结合起来，以保证检测的操作简便和费用低廉。
(4)规范性：本技术规范的编制，力求做到技术内容表达正确无误、文字表达简明易明白，以保证检测人员准确把握。
(5)操作性：本技术规范的编制，力求将操作过程中的要点进行细化和量化，以保证检测人员操作方便。
(6)兼容性：本技术规范的编制，参考和借鉴了国外同类标准或规范内容，以保证既符合国情又尽可能与国际接轨。
2、编制依据本技术规范编制的法律依据要紧有：(1)«农业转基因生物安全治理条例»——中华人民共和国国务院令第304号；(2)«农业转基因生物安全评判治理方法»——中华人民共和国农业部令第8号；(3)«农业转基因生物进口安全治理方法»——中华人民共和国农业部令第9号；(4)«农业转基因生物标识治理方法»——中华人民共和国农业部令第10号。
3、适用范畴转基因抗虫棉花可从以下三个方面进行检测：(1)筛查检测：利用通用序列分别设计引物对棉花Sad1内标准基因、CaMV35S启动子、NOS终止子以及cry1Ac基因或者cry1Ab基因或者cry1Ac和cry1Ab的融合基因进行PCR扩增，筛查确定样品是否含有转基因成分，以判定送〔抽〕检样品是否为转基因抗虫棉花。
(2)特异性检测：利用外源基因特异序列设计特异性引物对转基因抗虫棉花品种进行PCR扩增，检测确定样品所含外源基因类型，以判定送〔抽〕检样品是否为国家批准种植或在国家批准区域内种植的转基因抗虫棉花。
(3)品种〔组合〕鉴定：结合转基因抗虫棉花品种〔组合〕的特点、特性检测与鉴定，进一步检测或鉴定转基因抗虫棉花的品种〔组合〕名称，以判定该品种〔组合〕是否为国家批准种植或在国家批准区域内种植的转基因抗虫棉花。
具体检测技术路线流程如以下图所示，可依照检测工作的实际需要，选择相应的检测技术路线。
转基因抗虫棉花检测技术路线流程图本技术规范规定了转基因棉花定性PCR筛查方法，适用于转基因棉花中转基因成分的定性PCR筛查。
特异性检测和品种〔组合〕鉴定的技术规范，将依照实际情形适时予以公布。
4、检测方法本技术规范包括棉花的Sad1基因和转基因抗虫棉花中的CaMV35S启动子、NOS终止子、cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ac 与cry1Ab融合基因的定性PCR筛查方法。
5、检测条件本技术规范实施的检测机构应具备以下条件：(1)具备PCR检测所需的仪器设备和技术人员；(2)具备相对独立的分子生物学检测实验室及其配套设施；(3)客观、公平和中立，不从事转基因棉花的研发工作；(4)承担检测的法律义务和责任，按规定对检测结果保密；(5)严格执行农业部质量检验监督中心的治理规定和检测程序。
本技术规范受农业部农业转基因生物安全治理办公室托付，由农业部科技进展中心、中国农业科学院、南京农业大学、中国科学院、山东省农业科学院、吉林省农业科学院编制。
编制人员：魏启文、刘信、宋贵文、沈平、汪其怀、张永军、金芜军、崔洪志、周宝良、田颖川、吴家和、路兴波、张明等。
二oo五年三月转基因抗虫棉花检测技术规范——定性PCR筛查方法〔试行〕1 范畴本技术规范规定了转基因抗虫棉花定性PCR筛查方法。
本技术规范适用于转基因抗虫棉花中转基因成分的定性PCR筛查2 规范性引用文件以下文件中的条款通过本技术规范的引用而成为本技术规范的条款。
凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单〔不包括勘误的内容〕或修订版均不适用于本技术规范，然而，鼓舞依照本技术规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本技术规范。
NY/T672 转基因植物及其产品检测通用要求NY/T673 转基因植物及其产品检测抽样3 术语和定义以下术语和定义适用于本部分。
3.1Sad1基因Sad1〔s tearoyl-a cyl carrier protein d esaturase；Genbank No. AJ132636〕基因来源于陆地棉品种，该基因序列与其他植物〔海岛棉、小麦、玉米、大麦、烟草、西红柿、油菜、水稻、向日葵等〕类似基因的序列同源性专门低。
Sad1基因在陆地棉基因组内含有两个拷贝。
具体序列见附录A。
3.2cry1Ac基因人工合成苏云金芽孢杆菌晶体蛋白1Ac基因。
cry1Ab基因人工合成苏云金芽孢杆菌晶体蛋白1Ab基因。
cry1Ac与cry1Ab融合基因3.3转基因抗虫棉花本技术规范中转基因抗虫棉花指含有cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac 与cry1Ab融合基因,具有对靶标昆虫具有毒杀功能的棉花。
4 原理针对现有转基因抗虫棉花普遍含有的棉花Sad1内标准基因、CaMV 35S启动子、nos终止子以及cry1Ac基因或者cry1Ab基因或者cry1Ac与cry1Ab融合基因，设计这些序列的特异性引物进行PCR扩增，以筛查棉花中是否含有转基因成分。
5 试剂、材料及溶液配制除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。
5.110 mol/L NaOH溶液：称取氢氧化钠80 g，先用160 mL水溶解后，再加水定容到200 mL。
5.2 1 mol/L Tris-HCl称取121.1g Tris碱溶解于800 mL水中，用浓盐酸调pH至8.0，用水定容至1000 mL。
在103.4kPa, 温度为121℃,灭菌20 min后贮备使用。
5.3500 mmol/L 乙二铵四乙酸二钠〔EDTA〕溶液：称取乙二铵四乙酸二钠18.6 g，加入70 mL水中，再加入10 mol/L NaOH 溶液，加热溶解后，冷却至室温，再用10 mol/L NaOH溶液调pH至8.0，用水定容到100 mL。
在103.4kPa，温度为121℃，灭菌20 min。
5.4抽提液〔1000 ml〕药品终浓度称量样品葡萄糖0.35 M 69.3g1M Tris-HCl〔pH7.5〕0.1 M 100 ml0.5M EDTA〔pH8.0〕0.005 M 10 ml聚乙烯吡咯烷酮(K30)〔PVP〕2% (w/v) 20 gDIECA〔diethyldithiocarbamic acid〕0.1%(w/v) 1 gβ-巯基乙醇0.2%〔用时现加〕 2 ml重蒸馏水定容至1000ml 5.5裂解液药品终浓度称量样品氯化钠〔NaCl〕 1.4 M 81.7g0.5M EDTA〔pH8.0〕0.02 M 4ml1M Tris-HCl〔pH7.5〕0.1 M 100ml十六烷基三甲基溴化铵〔CTAB〕2%〔w/v〕20 gPVP (K30) 2% (w/v) 20 gDIECA 0.1% (w/v) 1 gβ-巯基乙醇0.2% (用时现加) 2ml重蒸馏水定容至1000ml 5.625苯酚:24氯仿:1异戊醇〔v/v〕5.724氯仿:1异戊醇〔v/v〕5.810 mg/ml RNase A将胰RNA酶〔RNase A〕溶于10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15 mmol/L NaCl 中，配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份储存于-20℃。
5.9异丙醇5.103 M乙酸钠〔pH 5.6〕O溶于800ml水中，用冰乙酸调pH至5.6，然后用水将408.1g乙酸钠·H2定容至1L，高压灭菌后备用。
5.1170%乙醇5.12TE缓冲液〔pH 8.0〕：1 mol/L Tris-HCl〔pH 8.0〕10 mL和500 mmol/L EDTA〔pH8.0〕溶液2 mL，用水定容至1000 mL。
在103.4kPa, 温度为121℃，灭菌20 min。
5.13琼脂糖5.14溴化乙锭〔EB〕溶液：10 mg/mL。
注意：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应该戴一次性手套操作。
5.15四种脱氧核糖核苷酸〔dNTPs〕各2.5 mmol/L的混合溶液。
5.1650×TAE缓冲液：称取 Tris 242.2 g，先用300 mL水加热搅拌溶解后，加100 mL( 500 mmol/L) EDTA的水溶液〔pH 8.0〕，用冰乙酸调pH至8.0，然后用水定容到1000 mL。
5.17Taq DNA聚合酶〔5单位/μL〕及PCR反应缓冲液。
5.18DNA分子量标准。
5.19加样缓冲液：称取溴酚蓝250 mg，加水10 mL，在室温下过夜溶解；再称取二甲基苯腈蓝250 mg，用10 mL水溶解；称取蔗糖50 g，用30 mL水溶解，混合三种溶液，用水定容至100 mL，在4℃下储存。
5.20引物。
5.20.1 Sad1基因。
s-F: CCAAAGGAGGTGCCTGTTCAs-R: TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC预期扩增片段大小为108 bp。
5.20.2 nos终止子序列。
nos-F：5'GAATCCTGTTGCCGGTCTTG3’；nos-R：5'TTATCCTAGTTTGCGCGCTA3’；预期扩增片段大小为180 bp。
5.20.3 CaMV35S启动子序列。
35S-F：5'GCTCCTACAAATGCCATCATTGC3'；35S-R：5'GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC3'；预期扩增片段大小为195 bp。
5.20.4 cry1Ac基因、cry1Ab基因、以及cry1Ac与cry1Ab融合基因序列通用引物cry1A-F：5’ GAAGG T TTGAGCAATCTCTAC 3’；cry1A-R：5’ C G ATCAGCCTAGTAAGGTCGT 3’；预期扩增片段大小为340 bp。
5.21引物溶液。
用TE缓冲液〔pH8.0〕分别将上述引物稀释到10 µmol/L。