基因水平
细胞衰老指征？？
23
1.5%
用cDNA芯片检测人二倍体成纤维细胞 衰老基因表达谱的变化 HGEC-40S: 含4096条人类基因，衰老表 达差异较大的基因有117种。
1.0%
0.5%
-0.5%
-1.0%
-1.5%
>2.0倍
>2.5倍
>3.0倍
24
细胞衰老的基因表达谱研究
老
衰老细胞与年轻细胞基因（4096条）芯片
9
人类“长寿基因的探索
Puca, AA （ Childrens Hosp ）与Perls, Thomas（ Boston Univ ）等 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001）报道： 分析137组 (308人)长寿同胞，百岁老人血样 发现：四号染色体 D4S1564 (D代表DNA, D后的数字表示染色体号,s代 表节段segment,s后的数字表示微卫星在染色体上的编号) 位点与众不同， 可能含有“长寿基因”。
13
细胞衰老 （Cell Senescence）
生物衰老的基本单位 老年病发病的共同基础
细胞衰老→老年退行性变→功能衰退 增殖能力下降→细胞数减少→脏器萎缩
细胞衰老是造成个体衰老的主要原因之一。
14
体外培养人类细胞衰老模型在研究人类衰老方面，具 有不可取代的优点：
１．无模式动物存在种族差异的缺点 ２．无人体实验取材难，操作难，周期长等缺点
4
如今，全球生命科学研究最热的三个领域是： 衰老、肥胖和癌症，衰老在其中独占鳌头。
人类对衰老的探究几乎从封建社会建立以来，就有所记载，然而， 真正进入科学研究衰老的范畴，还是近20年的事。 现在，国内外科学家对衰老的研究主要集中在哪些方面？从哪些 角度进行研究？科学家都取得了怎样的成就？
《生命世界》衰老的科学研究策划案 03 \30, 2006
表现有别
发病各异
↓因老而衰：
预防老年病 造福个人与家庭 节约社会财富
解放生产力
弄清衰老机理，可有的放矢,提出因应举措，
提高延衰效能。
3
发达国家近年意识到衰老与老年病的研究可望收益和 回报，纷纷改变理念，从福利观点，转到经济视角，既看 到社会需求，也看到无限商机，加强研究投入。 仅仅美国国会批准2005年度美国立衰老研究所（老年医 学基础研究为主），一个所的预算，达10亿5千万美元。
M. Kuro-o (Texas大学) “Cell senescence has been suggested to be directly related to senescence of living organism, including humans.” Cellular & Molecular Life Sciences 57(2000):695-697
钾离子通道（TPKC1）
Arbitary unit (TPKC1/B-actin)
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 PDL 60 80
0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 PDL 60 80
27
衰老时表达增强的5种基因
层粘连蛋白Laminin α 4亚基
HLH碱性磷蛋白G0S8
4096种中表达变化幅度>2.5倍的基因46种。
下调的基因：参与细胞周期的基因等。 上调的基因：细胞外基质有关基因等。
挑选表达变化大的基因，以RT-PCR技术对其再 检测。
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衰老时表达下降的4种基因
前脑啡肽原（Preproenkaphalin）
Arbitary unit (PPE/bactin)
2000年（第五次）我国人口普查 > 65岁 老人=总人口10% 约1.2亿 65岁以上人口： 7％14％ 法国需114年 2 中国需 27年 （美国人口局，U.S. Census Bureau预测）
老年病种类繁多（老年性痴呆,帕金森病等神经退行性疾病,老年
糖尿病、骨质疏松、心、脑血管、呼吸等系统疾患,以及肿瘤……）
段建明等 （Duan JM, et al.） Intl J Biochem Cell Biol 37 (2005) 1407–1420
（基因对寿命的影响）
•线虫(C. elegans )研究首次严格证明：单基因突变即可影响寿命 。 •clk 基因与daf-2基因双突变，线虫寿命延长5倍。
基因对衰老进程的主导性
②细胞的体外增殖能力 广泛应用于衰老研究。
20
A490nm E-03 /hour
15 10 5 0 30 40 50 60 70 ´ Á £ PDL£ ú ä ¨ © 人胚成纤维细胞体外培养代龄与细胞增殖速度的关系
19
Growth curves MTT assay
0
10
20
③衰老相关β半乳糖苷酶活性
硒蛋白P（Selenoprotein P）
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 PDL 60 80
0
20
40 PDL
60
80
Arbitary unit (GOS8/b-actin)
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
Arbitary unit (Laminin a4/bactin)
血管细胞粘附分子1 （VCAM1）
Perls： 一年以后见分晓 ？？？
10
Sebastiani P, et al.
Genetic Signatures of Exceptional Longevity in Humans. 老寿星的遗传特征 Science 2010 Jul 21. [Epub]
1055（ centenarians）：1267 （controls） 分析结果：建立了以150 SNPs (single-nucleotide polymorphisms)为基础的 分类模型。
⑤晚期糖基化终末产物
蛋白质糖基化与大分子交联，逐渐脱水， 形成的一种具有黄棕色荧光的产物。
8 7 6 4 3 2 1 0 0 20 40 ú ä ¨PDL£ ´ Á £ © 60 80
Fluorescence/mg protein
Determination of AGE
5 (Advanced Glycation End product)
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细胞衰老程度如何评估？ 衰老机制复杂，单一的衰老相关指标难以准 确、特异地评估衰老程度。 组建一套定量的细胞衰老生物学年龄指征 准确定量细胞衰老程度，可 1、研究各种因素对衰老进程的影响 2、检验药物抗衰作用，为中药现代化提供技术
支撑。
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分子水平
细胞衰老指征
①端粒长度 ②细胞体外增殖能力 ③晚期糖基化终末产物 ④衰老相关ß-半乳糖苷酶活性 ⑤ DNA损伤修复能力 ⑥DNA甲基化程度 ⑦线粒体DNA片段缺失
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新英格兰百岁老人研究中心(New England Centenarian Study)
衰老的实验性研究——成果累累
老年医学基础是人口老龄化需求的前沿学科
进行人类的衰老实验性研究,耗时费力,困难重重。
用动物实验研究衰老，由于人与动物差别大，实验结果，只能借鉴，不能 照搬。与细胞模型相互配合，可补动物实验之不足。
有丝分裂检控点蛋白（Mad2）
0.8
Arbitary unit (Mad2/B-actin)
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 20 40 PDL 60 80
0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 PDL 60 80
双泛素（Diubiquitin）
Arbitary unit (Diubiquitin/Bactin)
variation in survival to an age of about 85 years is determined by genetics
A. M. Herskind et al., Hum Genet 97, 319 , 1996
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平均寿命主要与环境相关；物种最高寿限与遗传相关。
不良环境可作用于遗传物质或其产物 影响衰老进程。
该模型用于另一组（百岁老人及其对照）：正确率 77% 。
芯片分析显示：
按差异SNP（或遗传特征 ）不同组合，可将90%的百岁老人分成19个群 体。一种组合可能与某一老年病(e.g., dementia, hypertension, and cardiovascular disease)易感性 有关，或可由此将健康老人的表型分成不同亚型。
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①我国端粒与人类细胞衰老相关性的研究 Southern blots
Telomere lengths
细胞越老，端粒越短， 电泳时跑得越快 端粒长度： 人类体细胞的计 时器。每增加1代龄，端粒 长度减少约49 bp。
+
中国人外周血淋巴细胞的端粒长 度每年平均缩短35 bp。
(张宗玉等，生物化学杂志,1995) 18
年轻细胞
衰老细胞
SA--βgal staining
人胚肺二倍体成纤维细胞(绿色者为衰老细胞)
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④ DNA损伤修复能力
损伤前 年 轻 细 胞 损伤
随增龄而下降
修复
comet assay 彗星试验
（单细胞凝胶电泳）
损伤前 衰 老 细 胞
损伤
修复
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尾长(μm) ；尾面积/总面积(%)
尾越长，%越高，损伤越重
细胞衰老分子机理研究进展
童坦君
北京大学 衰老研究中心 北京大学 基础医学院 生化系 2010 Nov 12 10:00
逸夫楼402室
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
生命科学永恒的主题————
健康、长寿