胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展（姓名：李翔单位：宁夏师范学院化学与化学工程学院11级科学教育班）摘要：胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团分离培养出来的具有发育全能性或多能性的干细胞,具有多向分化潜能和自我更新的特性。

胚胎干细胞可以定向诱导分化生产组织和细胞,可为细胞移植提供无免疫原性的材料,为难以治愈的疾病的细胞移植治疗提供可能。

本文介绍了胚胎干细胞的诱导分化方法和应用。

关键词：胚胎干细胞;定向诱导分化;分化潜能;自我更新胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是从早期胚胎(桑椹胚、囊胚)或原始生殖细胞(primordial germ cell,PGCS)分离出来的能在体外永久培养的、具有多方向分化潜能和种系嵌合能力的细胞系。

ES细胞具有多向分化潜能,可分化形成外胚层、中胚层和内胚层细胞的谱系干细胞,再成长为不同的神经、造血、肌肉,骨骼等各种细胞基于其特性,目前普遍认为,ES细胞对体外研究动物和人胚胎的发生发育,基因表达调控,药物的筛选和致畸实验及作为组织细胞移植治疗,克隆治疗和基因治疗的细胞源及产生克隆和转基因动物等领域将产生重要的影响。

1998年,T homson和Gearhart2个研究组分别从人ICM和PGCS建立了人类ES细胞系,在国际上引起了轰动。

Science杂志将人类ES细胞研究成果评为1999年世界十大科技进展之首,美国《时代》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首,并认为ES细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域,由此掀起了ES细胞研究的高潮。

1体外诱导ES细胞的原理在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。

在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。

从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异。

这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。

ES细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化[2]，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。

2体外诱导ES细胞的方法体外诱导ES细胞的常用方法是将ES细胞进行悬浮培养或悬滴培养，使其形成类胚体(Embry-oid Bodies,EBs)，该结构的分化过程与体内胚胎的早期发育过程相似。

首先将EBs消化成单细胞，然后再贴壁培养，并于不同的培养阶段添加不同种类和不同浓度的化学物质、条件培养基或细胞因子等诱导条件，直接促进ES细胞定向分化为某种特殊类型的细胞；或通过改变培养条件对某些类型的细胞分化起抑制作用，从而高效诱导目的细胞的分化。

改变细胞的培养条件使ES细胞进行定向分化的基本策略有三种：一是向培养基中添加生长因子和化学诱导剂等；二是将ES细胞与其它细胞一起进行培养；三是将细胞接种在适当的底物上，以促使细胞中某些特定基因的表达上调或下降，从而引发细胞沿着某一特定谱系进行分化。

体外诱导胚胎干细胞的物质有化学试剂诱导法、细胞因子诱导法和外源基因诱导法。

2.1化学试剂诱导法一些化学试剂加入到ES细胞中与其共培养后，会使得ES细胞发生定向分化，因此有时用相关化学试剂对ES细胞进行定向诱导分化。

例如视黄酸(又称维甲酸，RA)就是一种强烈的分化诱导剂。

20纪初，人们仅仅认识到维生素A(VA)是一种重要的营养物质，特别在视循环中发挥着重要生理作用，妊娠期V A缺乏有可能导致胎儿畸形。

后来发现在胚胎发育过程中，RA沿胚轴形成浓度梯度，影响胚胎背腹部和四肢的形成，从而推测其对胚胎发育起重要的激素样调节作用。

维甲酸是体外诱导ES细胞定向分化的常用因子。

一般认为维甲酸进入细胞后，首先与细胞质中CRABP(cellular RA binding protein)形成复合物，然后复合物进入核内，维甲酸与染色质上的受体结合，从而调控一系列基因的表达，使细胞的表型发生转变。

而Forester的实验结果表明，维甲酸不但能拮抗DIA对ES细胞的分化抑制作用(这提示有共同作用环节存在的可能)，而且也可影响分化程序和方向的选择。

除了视黄酸之外，还有维生素C(VC)、维生素K3(VK3)、过氧化氢、β-磷酸甘油、地塞米松和2，5-羟基维生素D3，二甲基亚砜（DMSO）等化学试剂也能诱导胚胎干细胞定向分化成为一些特种类型细胞。

2.2细胞因子诱导法细胞因子能显著改变ES细胞的发育途径。

ES-D3细胞与骨髓基质细胞RPO.10共培养时，单独添加重组白细胞介素-6(rIL-6)可诱导ES细胞分化为F4/80+星形巨噬细胞和成纤维细胞，不形成Thy-1+、B-220+、Joro75+淋巴祖细胞。

SCF、TPO和胚胎条件培养液协同作用可诱导ESs细胞分化为造血干/祖细胞；神经生长因子(NGF)可促进EBs中神经元样细胞的形成，成纤维细胞生长因子-2(FGF2)能使ES细胞分化的神经祖细胞进一步分化为功能性神经元；FGF2、EGF、血小板源生长因子(PDGF)与神经前体细胞条件培养基可协同诱导ES细胞分化为寡树突胶质细胞；巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)可抑制造血细胞发育和诱导巨噬细胞分化；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)则使ES细胞分化为树状细胞(DC)，且经IL-4、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和ant-CD40mAb(LPS)刺激后可转化为成熟的树状细胞。

2.3外源基因诱导ES细胞的定向分化法导入外源性基因也可使ES细胞发生定向分化。

若把在特定发育阶段中起决定作用的基因导入ES细胞基因组中，将会使细胞准确地分化为某一特定类型的细胞。

但在应用这一方法时，首先必须确定决定细胞向不同方向分化的关键基因，其次还要保证在适当的时候将该基因导入ES细胞基因组的正确位置上。

目前已经有报道表明用这种方法可使ES细胞定向分化为神经细胞、肌细胞、胰腺细胞等。

2.4转基因诱导法转基因诱导法主要是利用基因转染技术将某些信号转导成分的基因转入胚胎干细胞中，使某个促分化基因在胚胎干细胞中过表达，从而有效地诱导胚胎干细胞发生特异性分化。

沈干等将外源TGF-B基因转染小鼠胚胎干细胞，杂交实验证实转化生长因子B(TGF-B基因)整合到胚胎干细胞基因组，并表达外源TGF-B的mRNA，然后以悬滴法培养胚胎干细胞，7d后发现胚胎干细胞被诱导为具有内皮细胞特征的细胞，作者同时发现，外源rhTGF-B在培养基中对胚胎干细胞分化有明显促进作用，这种方法诱导胚胎干细胞分化的效率高，得到的分化细胞的纯度也较高，具有应用前景。

3胚胎干细胞的定向诱导分化研究对小鼠胚胎干细胞的研究证明，胚胎干细胞可在体外诱导分化为起源于外胚层的神经细胞、上皮细胞和表皮样干细胞，起源于中胚层的心肌细胞、造血细胞和内皮细胞，起源于内胚层的肝细胞和胰岛细胞等。

目前胚胎干细胞的定向分化研究主要关注于培养方法的改进和分化诱导剂的针对性选择。

3.1由胚胎干细胞向神经细胞的诱导分化人胚胎干细胞可以在体外诱导生成神经干细胞、成熟神经元和神经胶质细胞,且易于在体外培养和扩增，能无限增殖。

因此，人胚胎干细胞是将来神经系统细胞替代治疗的最佳“种子”细胞。

目前,各种诱导生成神经细胞的方法层出不穷,但相关实验表明失去了分化潜能的终末细胞移植入受体后难以成功整合到受体脑组织,并会很快死亡。

因而诱导分化得到的神经干细胞移植仍然是治疗的重要途径。

冯树梅等采用无血清、低密度快速诱导胚胎干细胞向神经前体细胞分化的方法,在短期内得到了大量可用于移植的细胞。

免疫细胞化学和RT-PCR分析表明，所得到的细胞为高纯度的神经前体细胞,其分化率接近100%。

但高纯度前体细胞仍有致瘤性，可能该细胞的发育学地位更加接近于胚胎干细胞,对其发育学表型的进一步探讨，将为胚胎干细胞来源的神经前体细胞的研究奠定基础。

最近,李晓丰等利用采用序贯诱导法，模仿体内胚胎细胞的生长、分化环境，按胚胎干细胞生长阶段逐步改变血清浓度和培养液成分，逐步添加生长因子、神经营养因子等，最终诱导胚胎干细胞高比率定向分化为神经元样细胞。

3.2向造血细胞的定向分化造血细胞包括造血干细胞、造血祖细胞、谱系定型前体细胞以及各种成熟血细胞。

自20世纪80年代初小鼠的胚胎干细胞建立细胞系以来，人们就开始了从胚胎干细胞向造血系统分化的研究。

习佳飞等利用形成拟胚体的方法诱导人胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞和更早期的血液血管干细胞。

同时以脐带血来源的造血干细胞作为起始细胞高效特异地诱导其向红系祖细胞分化,获得了在体外能够大规模扩增的红系祖细胞，并最终用24周胎龄的人胎肝基质细胞与红系祖细胞共培养实现了红系祖细胞的高效脱核生成成熟红细胞，为人胚胎干细胞体外诱导分化为成熟红细胞奠定了实验基础。

人胚胎干细胞体外分化为造血细胞不仅具有应用前景，而且对于研究造血发育研究具有重要的意义。

3.3向心肌细胞定向分化自从Doestschman等发现胚胎干细胞在一定条件下可以分化形成心肌细胞后,胚胎干细胞便成为研究心脏基因表达和功能的有用工具。

Kehat等在体外将人的胚胎干细胞成功诱导分化成心肌细胞，这些细胞中有8.1%可自发收缩，收缩时间最长可持续5周。

Chen的研究结果显示,给心肌梗死鼠注入胚胎干细胞不仅可使病鼠的存活率提高，而且注入的干细胞可以分化成心肌细胞，但是分化作用不具有选择性。

3.4向内皮细胞的定向分化内皮细胞对组织修复、再生和组织工程移植物内皮化或再血管化有重要作用,但是成熟内皮细胞体外增殖能力有限，很难满足再血管化的需要。

张斌等应用简单贴壁培养法,单纯采用血管内皮生长因子(VEGF)诱导，使胚胎干细胞贴壁分化、生长，通过传代、换液去除非贴壁细胞，得到较纯化的内皮样细胞。

H irashmi a等的研究发现诱导胚胎干细胞生成的内皮细胞比例与VEGF梯度浓度成正相关，表明VEGF对血管内皮发育呈剂量依赖性。

3.5向上皮细胞的定向分化胚胎干细胞可被直接诱导分化为视网膜细胞和视网膜色素上皮,诱导分化的视网膜细胞移植后能整合进视网膜，并表达光感受器细胞标记。

2008年2月日本京都大学的Takahashi等在体外成功诱导人胚胎干细胞高效分化为多角形视网膜色素上皮，同时向培养液中添加成纤维细胞生长因子(bFGF)、牛磺酸和维生素A酸，产生了大量的视锥细胞和视杆细胞。

此研究为治疗视网膜变性疾病(如黄斑变性或色素性视网膜炎)提供了一种可能的途径。

3.6向其他细胞的定向分化胚胎干细胞在一定条件下可以诱导分化为生殖细胞。