溶于95%乙醇的0.1%甲基红2ml混合而成。
凯氏定氮装置
自动凯氏定氮仪
(三)、实验步骤
一、 消化
称取样品0.5~1g，置于凯氏烧瓶内，不使沾染瓶颈.加入 1gK2SO4,0.5gCuSO4及6ml浓H2SO4，在通风橱内的消化炉上 加热，先用小火,待水分蒸发完后,可用较大的火焰.消化到瓶 内溶液呈透明的蓝绿色为止,但要瓶内无黑点,有则需要瓶内 溶液把它冲洗下去,再加热至澄清为止. 冷却，转入100ml容 量瓶中，以少许蒸馏水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中， 加水至刻度，摇匀。
蛋白质含量 = 含氮量×6.25
（二）实验原理
1. 有机物中的氮在强热和CuSO4、浓H2SO4 作用下，消化生成 (NH4)2SO4
含氮有机物+H2SO4→(NH4)SO4 +CO2+H2O+‥‥
2. 在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于 H3BO3 溶液中。
(NH4)SO4 +NaOH→Na2SO4+2NH3·H2O NH3·H2O-蒸馏→NH3+H2O NH3+H3BO3→(NH4)3BO3
第六章 蛋白质定量和定性分析
(Qualitative and quantitative analysis of protein)
本章内容
第一节 蛋白质含量测定 第二节 蛋白质分子量的测定 第三节 蛋白质纯度分析 第四节 糖蛋白中糖含量分析 第五节 蛋白质序列分析 第六节 生物质谱技术与蛋白质鉴定
第一节 蛋白质含量测定
三、计算 CP(mg/mL) = F×1/d×A280 F-校正因子 or CP(mg/mL) = 1.45×A280 – 0.74×A260
(经验公式） 四、优点及缺点 优点：⒈ 灵敏度高，20-100 μg/mL
⒉ 方法简单 ⒊ 盐类干扰少 ⒋ 蛋白质不需处理，可回收
缺点：对于测定与标准蛋白质中酪氨酸、色氨酸含 量差异较大的蛋白质有一定误差，故适于测定与 标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
e.一般消化至透明后,继续消化30min即可,但对于含有 特别难以消化的氮化合物的样品,如赖氨酸、组氨 酸、色氨酸等时,需适当延长消化时间.有机物如分 解完全,消化液呈蓝色或浅绿色,但含铁量多时,呈较 深绿色.
f.硼酸吸收液的温度不应超过40℃,否则对氨的吸收作 用减弱而造成损失.
g.蒸馏完毕后,应先将冷凝管下端提离液面,再蒸2min 后关掉热源,否则可能造成吸收液倒吸。
四、考马斯亮蓝法
一、原理
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考 马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收 在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸 收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定 量测定。
标准蛋白溶液的浓度。然后乘以稀释倍数，得出
未稀释样品含蛋白质的克数。
四.实验结果
• 计算： • 总蛋白含量=(蛋白含量/0.2ml)×总体积
注意：蛋白质中酪氨酸含量不同，生色强度 不同，所以使用同种蛋白质（同源Pr)作标 准，灵敏度比双缩脲反应高100倍
三、紫外光吸收法
一、原理
由于含有酪氨酸和色氨酸，大多数Pr在280nm处 有一明显吸收峰，可利用此快速灵敏地测定Pr浓度。 由于Pr样品中经常杂有核酸，对280nm光波也有吸 收，但不如260nm光波吸收强，可通过统计计算， 排除测定Pr含量时核酸的干扰。
（3）乙醇 （4）磷酸（85％）
三、操作步骤
1．标准曲线制作
（1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具 塞试管，按表1 取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混 合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色， 记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
二、Folin-酚试剂法
一、原理
蛋白质分子的肽键结构在碱性环境中能与Cu2+络合 成紫色络合物（双缩脲反应），但络合物颜色浅，吸 光度不易测出，故灵敏度低。
由于形成络合物后，蛋白质的肽链展开，使其中的 酪氨酸等残基充分暴露，而蛋白质中酪氨酸的酚基在 碱性条件下与酚试剂（磷钨酸-磷钼酸化合物）反应， 使高价的Mo6+和W6+还原生成低价的钼离子和钨离子， 呈铜蓝及钨蓝的颜色，蓝色的深浅与蛋白质含量成正 比。在一定范围内符合L-B定律（20-300μg/mL）
三.方法和步骤
• 1.标准曲线的制作:将6支干净试管编号，按下表进
行操作
表1.酪蛋白标准曲线的制作
管号
1
2
3
4
5
6
标准酪蛋白溶液/ml 0
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
蒸馏水/ml
1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0
Folin-酚试剂甲/ml 5.0
5.0
5.0
5.0
4 、用电炉加热,待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起 计时,继续蒸馏5min,然后将锥形瓶放低,使M管离开液面再 蒸馏2min,最后用蒸馏水洗导管外壁.取出锥形瓶,随即将 蒸馏器洗净
四、滴定
用0.01mol/LHCl滴定锥形瓶内溶液至淡紫色或灰色为止, 记录滴定所用HCl的量
五、蛋白质含量的计算
微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法
目前常用的有四种古老的经典方法:定氮法, 双 缩 脲 法 (Biuret 法 ) ， Folin- 酚 试 剂 法 (Lowry 法)和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍 使用起来的新测定方法,考马斯亮蓝法 (Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏 度高，比紫外吸收法高10-20倍，比 Biuret 法 高100倍以上。凯氏定氮法比较复杂，但较准 确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方 法的标准蛋白质。
一、微量凯氏定氮法
一、原理
蛋白质的主要组成元素C,H,O,N,S，各种蛋白质中含氮量 恒定在13%-19%，平均为16%。每100克蛋白质中含氮约为16 克。而且生物组织中的氮主要存在于蛋白质中，因此测定生 物组织中的氮含量可计算出蛋白质含量。
蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热 消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后 碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴 定，根据酸的消耗量乘以换算系数计算出蛋白质含量。
二 蒸馏器清洗
图中所示的蒸馏器使用方法如下:
开放自来水龙头,使水从E进入G, 从K流出,(水不宜开得过大以免水 从G溢出).开放P3使水进入A,从漏 斗D中加蒸馏水约10ml入B,用拇指 将G管口掀紧.同时开放P1则B中水 从Y型管中冲出.随后A中水经K流 出.一般情况下,如此重复洗涤两次 即可.若蒸馏器内有氨存在,则应加 入5ml蒸馏水和30%NaOH溶液2ml 后蒸馏一次方可使用.
表1 低浓度标准曲线制作
四、结果计算
式中：X 为在标准曲线上查得的蛋白质含量（μg）。
Bradford法的突出特点:
(1)灵敏度高.其最低检测蛋白质含量可达1mg,这是因为蛋白质 与染料相结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有 更高的吸光系数,因而光吸收要比Folin –酚试剂法大得多.
二取100mg 牛血 清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的 原液。
（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马 斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V） 的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在 常温下可放置一个月。
二.实验用品
• 1.材料：待测样品,使用前稀释至合适的倍数 • 2.试剂 • ⑴标准牛血清(或酪蛋白)溶液: 称取125毫克蛋白
粉末，用0.1N氢氧化钠溶液润湿，溶解，加蒸馏 水到250毫升，则配成500微克/毫升的标准蛋白溶 液。 • ⑵Folin-酚试剂甲 : • ⑶Folin-酚试剂乙: • 3.仪器设备
蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的 时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物 在室温下1h 内保持稳定。
该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单， 操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋 白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用 的微量蛋白质快速测定方法。
(2)测定快速,简洁,只需要加一种试剂.完成一个样品的测定,只 要5分钟左右 .由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分 钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20 分钟之间,颜色的稳定性最好.
(四)、注意事项
a.样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细，液 体样要混合均匀。
b.样品放入凯氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，以免被 检样消化不完全，使结果偏低。
c.样品中若含脂肪或糖较多,消化过程中易产生大量 泡沫,为防止泡沫溢出瓶外,在开始消化时应用小 火加热,并时时摇动。
d.当样品消化液不易澄清透明时,可将凯氏烧瓶冷却, 加入30%过氧化氢2-3mL后再继续加热消化.
5.0
5.0
摇匀，室温下放置10分钟
Folin-酚试剂乙/ml 0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
摇匀，在30℃保温（或室温下放置）30分钟
A 500nm
0
• 2.样品中蛋白的测定
•
取2支试管，分别加入0.2毫升样品(待测)稀
释液，再加入0.8毫升蒸馏水使样品体积达到1毫
升。
•
将样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的
试样中蛋白质的含量=(V1-V2) ×HClmol/L× 0.014× 20× 6.25×100% /W