分析草案项目名称：西北农林科技大学18个花绒寄甲转录组+18个小RNA+6个蛋白定量分析（iTRAQ)测序及分析合同（无参考基因组）委托人（甲方）：西北农林科技大学林学院受托方（乙方）：签订地点：签订日期：年月日有效期限：年月日至年月日1．项目描述1）材料说明：研究对象为花绒寄甲（Dastarcus helophoroides），实验方案是对4龄期L1、6龄期L2、蛹期L3、1年成虫L4、2年成虫L5、4年成虫L6共6个时间点（每个时间点有3个生物学重复）的样本进行18个转录组测序、18个Small RNA测序、6个ITRAQ蛋白定量实验。
其中，转录组、Small RNA测序使用同一样品。
2）项目背景信息与项目策略3）测序数据分组、合并及符号发育节点: 4龄期L1 6龄期L2蛹期L3 1年成虫L4 2年成虫L5 4年成虫L6原始重复数据：(1-3) (1-3) (1-3) (1-3) (1-3) (1-3)mRNA合并数据： X1 X2 X3 X4 X5 X6 X1-X6合并=T↓↓↓↓↓↓7组拼接数据：X1● X2● X3● X4● X5● X6●X1●-X6●合并=T●蛋白质翻译库X1d● X2d● X3d● X4d● X5d● X6d●Td●按照链特异性文库建库strand-specific RNA sequencing(Directional RNA-Seq)Small RNA合并：Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y1-Y6合并=U ↓↓↓↓↓↓↓注释比对库 Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 U蛋白质组数据： D1 D2 D3 D4 D5 D6 D1-D6合并=V ↓↓↓↓↓↓↓注释比对库 D1 D2 D3 D4 D5 D6 V对比15次： L1-L2，L1-L3，L1-L4，L1-L5，L1-L6；L2-L3，L2-L4，L2-L5，L2-L6；L3-L4，L3-L5，L3-L6；L4-L5，L4-L6；L5-L64）原始数据：每发育节点转录组3组重复数据；Small RNA的3组重复数据；蛋白组学1组数据。
合并数据：3个原始重复测序数据合并为1组再组装、mapping。
转录组X1～X6，组装库X1●～X6●；Small RNA 为Y1～Y6；蛋白质组为D1～D6。
总数据：转录组X1～X 6合并为T、组装库T●、再mapping，；Small RNA的Y1～Y6合并为U、再mapping；蛋白组学D1-6合并为V、再mapping，转录组蛋白翻译库W。
5) 经费包括测序及以下所有信息分析费在内，信息分析费不再另行支付。
1）材料说明：研究对象为花绒寄甲（Dastarcus helophoroides），实验方案是对4龄期L1、6龄期L2、蛹期L3、1年成虫L4、2年成虫L5、4年成虫L6共6个时间点（每个时间点有3个生物学重复）的样本进行18个转录组测序、18个Small RNA测序、6个ITRAQ蛋白定量实验。
其中，转录组、Small RNA测序使用同一样品。
2）项目背景信息与项目策略3）测序数据分组、合并及符号发育节点: 4龄期L1 6龄期L2蛹期L3 1年成虫L4 2年成虫L5 4年成虫L6原始重复数据：(1-3) (1-3) (1-3) (1-3) (1-3) (1-3)mRNA合并数据： X1 X2 X3 X4 X5 X6 X1-X6合并=T↓↓↓↓↓↓7组拼接数据：X1● X2● X3● X4● X5● X6●X1●-X6●合并=T●蛋白质翻译库X1d● X2d● X3d● X4d● X5d● X6d●Td●按照链特异性文库建库strand-specific RNA sequencing(Directional RNA-Seq)Small RNA合并：Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y1-Y6合并=U ↓↓↓↓↓↓↓注释比对库 Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 U蛋白质组数据： D1 D2 D3 D4 D5 D6 D1-D6合并=V↓↓↓↓↓↓↓注释比对库 D1 D2 D3 D4 D5 D6 V对比15次： L1-L2，L1-L3，L1-L4，L1-L5，L1-L6；L2-L3，L2-L4，L2-L5，L2-L6；L3-L4，L3-L5，L3-L6；L4-L5，L4-L6；L5-L64）原始数据：每发育节点转录组3组重复数据；Small RNA的3组重复数据；蛋白组学1组数据。
合并数据：3个原始重复测序数据合并为1组再组装、mapping。
转录组X1～X6，组装库X1●～X6●；Small RNA 为Y1～Y6；蛋白质组为D1～D6。
总数据：转录组X1～X 6合并为T、组装库T●、再mapping，；Small RNA的Y1～Y6合并为U、再mapping；蛋白组学D1-6合并为V、再mapping，转录组蛋白翻译库W。
5) 经费包括测序及以下所有信息分析费在内，信息分析费不再另行支付。
2．目标及技术内容(流式细胞仪预测该虫基因为235M，已完成了1个成虫样2G转录组测序，注释率80%)（1）Hiseq 2000完成 18个（花绒寄甲Dastarcus helophoroides）RNA样品链特异性转录组测序,每个样品产生4Gb clean data以上，并完成相应的信息分析。
Q20 95%以上，Q30 90%以上（2）Illumina完成18个（花绒寄甲Dastarcus helophoroides）RNA样品Small RNA测序（包括miRNA，rRNA，tRNA，snRNA，piRNA，snoRNA，microRNAs，siRNA，miRNAs等），保证每个样本产生不低于15～20M的clean reads，并完成相应的信息分析。
Q20 95%以上，Q30 90%以上（3）运用iTRAQ技术，完成6个样品的蛋白组学定量分析。
对6个（花绒寄甲Dastarcus helophoroides）样品进行标记，将液相色谱与质谱联用，保证每个样本产生的蛋白质数不少于转录组注释数据量的1/10、鉴定非冗余蛋白质数不少于转录组数据量的0.6/10（果蝇9124个），通过生物信息分析鉴定蛋白和比较差异蛋白的表达量，并完成相应的信息分析。
3．转录组技术路线3．1 项目描述对18 个RNA样品进行检测，样品检测合格后采取以下技术路线对转录组进行测序：常规转录组测序样品制备――上机测序（每个样品产生 4Gb clean data）――生物信息学分析。
发育节点: 4龄期L1 6龄期L2蛹期L3 1年成虫L4 2年成虫L5 4年成虫L6原始重复数据：(1-3) (1-3) (1-3) (1-3) (1-3) (1-3)mRNA合并数据： X1 X2 X3 X4 X5 X6 X1-X6合并=T7组组装数据：X1● X2● X3● X4● X5● X6●X1●-X6●合并=T●功能注释√√√√√√√ORF/CDS预测√√√√√√√1 SSR/SNP分析√√√√√√√lncRNA预测√√√√√√√蛋白质翻译库 X1d● X2d● X3d● X4d● X5d● X6d●Td●按照链特异性文库建库strand-specific RNA sequencing(Directional RNA-Seq；trinity组装对比15次： X1-X2，X1-X3，X1-X4，X1-X5，X1-X6；X2-X3，X2-X4，X2-X5，X2-X6；X3-X4，X3-X5，X3-X6；X4-X5，X4-X6；X5-X61）项目分析流程（1）转录组denovo 组装单独拼接：每个发育时期3个生物学重复样本测序数据合并为1组后进行链特异性组装。
六个发育时期转录组数据X1～X6，按照链特异性文库进行组装获得6个转录本(Ttranscript)，之后使用CD-HIT软件聚类获得各自的Unigene。
（2）混样拼接：将六组不同发育时期，三次生物学重复的样本测序数据合并为T, 通过拼接组装为大转录本T●(Ttranscript)，使用CD-HIT软件聚类获得其的Unigene。
（3）组装结果评估：将组装得到转录本与NCBI中该物种或近源物种的已知序列（转录本或基因组）进行比对，评估组装结果。
2）功能注释将通过拼接获得转录本X1●-X6●、T●的蛋白数据库（nr、Swiss-Prot、IPR、TrEMBL、KEGG和KOG等数据库）进行比对，通过被比对序列的相似行进行功能注释。
3）KEGG 注释转录组的 KEGG 注释主要是对得到的基因注释进行 KEGG Pathway 分析，此分析是基于预测得到 ORF 序列，利用 KAAS 预测得到对应的 KO 号，然后利用 KO 号对应到KEGG pathway 上，分析基因与 KEGG 中酶注释的关系文件以及映射到 pathway 的信息。
4）GO注释 5）KOG分类6）预测编码蛋白框CDS（ESTScan预测） 7）转录本的可变剪切异构体isoforms分析8）转录本SSR和SNP分析 9）lncRNA的预测将未比对上蛋白数据库的序列作为lncRNA的预测候选序列，与已知lncRNA数据比对进行预测。
10）mRNA表达分析将使用T●为参考序列，将18个样本（六个发育时期三次生物学重复）的原始数据reads分别mapping到T●序列上进行基因表达定量分析。
11）差异基因分析12）差异表达基因功能富集性分析（GO富集分析和KEGG代谢通路富集分析）13）时空表达顺序分析 14）基因共表达网络分析15）补充说明：（1）以上1-9项分析项目7个转录本（X1●-X6●、T●）平行分析。
（2）将使用T●为参考序列，将18个样本（六个发育时期三次生物学）的原始数据reads分别mapping到T●序列上进行基因表达定量分析。
（同一个物种不同发育时期的基因组序列是一样，所以基因对应转录产物mRNA也是一致的。
不同的发育时期只存在基因表达或不表达的情况。
每个发育时期单独拼接的转录本只代表该时期的基因表达情况，而T●涵盖该物种6个时期所有基因表达情况。
若某个时期有测序reads能mapping到T●的某个转录本，则表示该转录本有表达，否之则为不表达。
）（3）后续蛋白定量分析，使用T●所对应的蛋白序列为Td●参考序列。
3．2 生物信息学分析内容1．对原始数据进行去除接头序列及低质量reads的处理1）原始数据L1(1-3)、L2(1-3)、L3(1-3)、L4(1-3)、L5(1-3)、L6(1-3) 测序产量统计2）L1(1-3)、L2(1-3)、L3(1-3)、L4(1-3)、L5(1-3)、L6(1-3)测序质量与测序错误●测序质量Q与测序错误E；●GC/AT碱基组成分布，原始数据处理后质量及碱基质量分布（fastqc工具）；●测序饱和度分析测序饱和度分析图；●raw data产出统计，raw data 及clean data的数据量及 Q20、Q30 统计，raw data及clean data 测序质量分布图，duplicate rate 统计3）测序随机性分析2. 转录组组装与分析（可首选赤拟谷盗**Tribolium castaneum、次选家蚕*Bombyx mori，或侯选黑腹果蝇Drosophila melanogaster、冈比亚按蚊Anopheles gambiae、意大利蜜蜂Apis mellifera、埃及伊蚊Aedes aegypti做参考靠基因，但公司在选择时必须慎重，一旦选定，后边其他分析所使用的参考基因组，也必须是该处所选定的种类；也可直接以T●作为参考基因，因为T●数据量肯定超过各个发育节点的数据量。