作为载体的必要条件：
记一记
1、能自我复制或整合到受体染色体DNA上 随染色体DNA的复制而同步复制； 2、有一或多个限制酶的切割位点； 3、必须带有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择 4、对受体细胞无毒害 5、大小应合适，便于提取和体外操作。
载体的作用
相当于一种运输工具，将外源基因转移到受体细胞中去。
2、将目的基因导入动物细胞 方法: 显微注射技术 常用受体细胞：受精卵 操作程序: 提纯含目的基 因表达载体
取受精卵
显微注射
移植到子宫 受精卵发育 新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
常用法：Ca2+处理 （用Ca2+处理，增加细菌细胞壁的通透性） 常用受体细胞：大肠杆菌
微生物作受体细胞原因：
下图表示DNA片段，有关该图的叙述中，不正确的是
B
A．②③④构成了DNA的基本组成单位 B．②③④的特定排列顺序所含的遗传信息能指导蛋 白质的合成 C．解旋酶可使⑤处的化学键断裂 D．DNA连接酶可连接①处断裂的化学键
3.基因的运输工具——运载体
常用的运载体：
质粒、λ噬菌体的衍 生物和动植物病毒等。 质粒存在于许多 细菌和酵母菌等生物 中,是细菌拟核DNA之 外能够自主复制的很 小的双链环状DNA分 子。
c、终止子
d、标记基因
三、将目的基因导入受体细胞 转化: 受体细胞 目的基因进入_____ ____内，并且在受体 表达 __的过程。 细胞内维持_ 稳定 ___和___ 常用方法：
1、导入植物细胞: 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
2、导入动物细胞: 显微注射法
3、导入微生物细胞: 感受态细胞法（或Ca2+转化法）
1、将目的基因导入植物细胞
能感染双子叶植物和祼子植 特点: 物,对单子叶植物无感染能力 Ti质粒的T—DNA可转移至受体 细胞并整合到其染色体上 转化过程:
（1）农杆菌 转化法
表 植 Ti质粒 构建 达 转入 农 导入 植物细胞 表达 新 插入 物 杆 性 染色 DNA 载 细 菌 状 目的基因 体 胞
基因拼接技术
=
DNA重组技术
对基因工程的概念的理解
目的基因 。 1.供体：提供_________ 记一记 2.操作环境：_____ 体外 。 3.操作水平：_____ 分子水平。 4.原理：_________ 基因重组 。 5.受体：表达目的基因。 6.本质：性状在_____ 受体 体内表达。 7.优点：克服________ ________障碍，定向改 远缘杂交不亲和 造生物_____ 性状 。
4、个体生物学水平的鉴定
抗虫鉴定、抗病鉴定、 活性鉴定等
1、3 基因工程的应用
1.转基因植物 类别 抗虫 抗病 应 用 实 例
杀虫的基因主要有Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂 基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等 抗病毒基因:病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因; 抗真菌基因:几丁质酶基因和抗毒素合成基因 抗盐碱和抗干旱的调节细胞渗透压基因、 抗冻蛋白基因、抗除草剂基因 ①转基因玉米中赖氨酸的含量比对照提高30% ②转基因延熟番茄储存时间可延长1～2个月 ③转基因矮牵牛呈现出自然界没有的颜色变异
2、转录检测 目的：检测目的基因是否转录出了mRNA
方法： 分子杂交技术
探针：用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段
杂交的对象：从转基因生物中提取的mRNA.
3、翻译检测
目的： 检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法:
抗原抗体杂交技术 抗原： 从转基因生物中提取的蛋白质 抗体： 将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进 行免疫产生的相应抗体
（Taq酶）
结果
大量的DNA片段
（3）人工合成
反转录法：
目的基因的mRNA 反转录酶 杂交双链 (单链RNA/单链DNA) 单链DNA DNA聚合酶
根据已知的氨基酸 序列合成DNA法 ：
蛋白质的氨基酸序列 推测 mRNA的核苷酸序列
推测 基因的脱氧核苷酸序列
化学合成 目的基因
双链DNA (目的基因)
目的基因 载体
同一种限制酶
T4 DNA连接酶 15º C
目 的 基 因 与 运 载 体 结 合
目的基因 自连
重组体
载体自连
2、基因表达载体的作用
a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代
b、同时使目的基因能表达和发挥作用
3.基因表达载体的组成：
a、目的基因
b、启动子 位于基因的首端,是mRNA识别并结合 位点。 位于基因的末端,终止转录。 检测受体细胞中是否有目的基因，从 而将含有目的基因的细胞筛选出来。
二、基因表达载体的构建——核心 1.过程:
（1）用一定的_________ 限制酶 切割 质粒，使其出现一个切口，露 黏性末端 。 出____________ 同一种限制酶 （2）用_________ __切断目 的基因，使其产生_____ 相同的黏性末端 ____________。 （3）将切下的目的基因片段插入质粒的______ 切口 处， 再加入适量___________ ，形成了一个重组DNA分 DNA连接酶 子（重组质粒）
要切两个切点，产生四个黏性末端，两个。
• 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会 怎样呢？ 会产生相同的黏性末端。 • 是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成 重组的DNA分子了? 实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。
思考
限制酶存在于原核生物中的作用是什么? 原核生物容易受到外源DNA的反将含有某种生物不同基因的许多DNA片断， 导入到受体菌的群体中，各个受体基因动物
类别
提高生 长速度 改善畜
应
用羊和转外源生长激素基因 鲤鱼生长速率快、体型大
如将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组,使获得的转基因 牛分泌的乳汁中,乳糖的含量大大减低,而其他营养 产品品质 成分不受影响 目前,已在牛和山羊等动物乳腺生物反应器中表达出 生产药物 了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α-抗胰蛋白 酶等重要药品 科学家正试图利用基因工程方法对猪的器官进行改 作器官移 造,抑制抗原决定基因的表达,或设法除去抗原决定 植的供体 基因,再结合克隆技术,培育出没有免疫排斥反应的 转基因克隆猪器官
区别1
只能将单个核苷酸连接 在两个DNA片段之间 到已有的核酸片段上， 形成磷酸二酯键 形成磷酸二酯键
以一条DNA链为模板。 不需要模板。 区别2 将单个核苷酸通过磷酸 将DNA双链上的两个 二酯键连接成一条互补 缺口同时连接起来。 的DNA链 相同点 形成磷酸二酯键，都是蛋白质
反馈练习：
以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析： ①GC… ②AATTC… ③ …GC ④ …CTTAA CG… G… …CG …G (1)其中①和 是由一种限制酶切割形成的 末 端，两者要重组成一个DNA 分子，所用DNA连接酶通 常是 。 （2） 和 是由另一种限制酶切割形成的 末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常 是 。
E.coliDNA连接酶
(2)、分类
(1)、来源： 大肠杆菌 (2)、作用： “缝合”黏性末端
T4DNA连接酶
(1)、来源： T4噬菌体 (2)、作用： “缝合”黏性末端和平末端
想一想:DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?
• DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
DNA聚合酶 DNA连接酶
过程：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
感受态 细胞 感受态细胞 吸收DNA
Ca2+处理 大肠杆菌
表达载体 与感受态 细胞混合 处于能吸收周围环境中 DNA分子的生理状态的 细胞
四、目的基因的检测与鉴定
1、导入检测
目的： 方法： 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入 了目的基因 DNA分子杂交技术
过程：①.首先取出转基因生物的基因组DNA ②.将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等 作标记,以此做探针。 ③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示 出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中
转基因生
物的DNA 探针
14N 14N
变性
15N 15N
变性
探针： 用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段 杂交的对象： 从转基因生物中提取的基因组DNA
大
有
小 无 无
某种生物的部 分基因
有
某种生物的全部 基因
部分基因可以
可以
（2）利用PCR技术扩增目的基因
1、定义：PCR——多聚酶链式反应
是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
通过此技术，可获取大量的目的基因。
2、原理： DNA复制 3、条件： 一段已知目的基因的核苷酸序列 模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸； 热稳定DNA聚合酶（Taq酶）能量 4、过程： 指数 方式扩增， 以_____ 5、方式： 即____ 2n （n为扩增循环的次数） 6、仪器： PCR扩增仪
（2）种类：4000种。
识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并 （3）作用： 且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键断开。(6个,4、5、8个)
（4）结果： 形成两种末端
黏性末端 平末端
思考题： • 要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切点？可 产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？
PCR技术扩增与DNA复制的比较
相 原理 同 原料 点 条件
解旋 方式
PCR技术 DNA复制 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶
高温下变性解旋 解旋酶催化 主要在细胞核内 解旋酶、 普通的DNA聚合酶等 形成整个DNA分子
不 同 场所 体外复制(PCR扩增仪内) 点 热稳定的DNA聚合酶 酶
限制酶的作用:切割外源DNA,使之失效 保证自身的安全