拮抗化疗药物体外免疫抑制模型的建立及活性成分筛选
以小鼠脾淋巴细胞为试验材料 , 将有丝分裂原刀豆蛋白
A(ConA)或细菌脂多糖(LPS)与化疗药物5氟尿嘧啶(5 Fu)联合使用建立了体外免疫抑制模型，并比较了多糖样品对5 Fu抑制淋巴细胞增殖的拮抗作用。
结果表明 , 在供试样品中 ,F1 1[ 龙须菜 (Gracilaria lemaneiformis) 中分离多糖]和BW沪农灵芝1号(Ganoderma lucidum) 子实体中分离 ] 对 5 Fu 产生的轻度抑制有完全拮抗作用,19号[沪农灵芝1号(G. lucidum)子实体中分离] 样品刺
激淋巴细胞增殖活性最好 , 但对 5 Fu 产生的抑制基本无拮抗作用 , 表明样品刺激淋巴细胞增殖的活性与拮抗化疗药物抑制淋巴细胞增殖的活性无正相关性。
免疫抑制 ; 化疗药物 ; 多糖
肿瘤是危害人类健康的严重疾病 , 对其发生机制及治疗手段的
研究一直是医学领域的热点 [1] 。
目前化疗仍是临床上治疗肿瘤的三大有效手段之一 , 化疗在杀灭患者体内的癌细胞方面有很好的效果 , 但均有不同程度的毒副作用 , 如化疗后往往会出现白细胞减少 , 特别是中性粒细胞减少 , 血小板减少等情况 [2], 严重的会造成人体免疫功能降低甚至是免疫功能缺陷 [3], 限制了化疗药物的使用 , 影响到癌症的治疗效果。
因此 , 寻找能减轻化疗药物免疫抑制副作用的活性成分 , 对提高化疗药物的治疗效果和扩
大其适用范围有重要的意义。
研究表明 ,多糖具有免疫调节和抗肿瘤活性 , 其抗肿瘤活性主
要是通过调节机体的免疫功能而间接实现的 [4], 实验表明多糖在减轻化疗药物免疫抑制副作用方面效果明显 [5] 。
如今多糖药物作为免疫调节剂已经成为辅助化疗、放疗和手术治疗肿瘤的重要组成部分。
但多糖种类繁多、结构复杂 , 为了更好地对其进行开发利用 , 需要建立有效的活性筛选模型。
常用的筛选减轻化疗药物免疫抑制副作用的模型多为动物体内模型 [6,7], 结果可信度高 , 但由于其耗时长、费用高、所需的样品量大等缺点 ,不适用于大量样品的初筛及样品分离过程中各组分活性的跟踪检测。
若利用高效的体外细胞筛选模型进行初步筛选 , 获得相关的线索后再进行体内试验验证 , 将能大大提高活性成分的筛选效率。
雷林生等 [8] 利用不同品系小鼠淋巴细胞相互作用后会引起淋巴细胞增殖这一特性 , 在细胞水平上考察了灵芝多糖拮抗抗肿瘤药物免疫抑制作用的效果 ,但该模型应用少、操作较复杂 ,因此需要建立方便、有效的筛选体系。
5 氟尿嘧啶 (5 Fu) 为临床上常用的化疗药物 , 主要副作用为
骨髓抑制 , 对在体内处于增殖状态的免疫细胞损伤较大。
为了筛选拮抗化疗药物免疫抑制作用的样品 , 本研究取用小鼠的脾淋巴细胞,通过外加有丝分裂原刺激其增殖 , 模拟体内免疫细胞快速增殖的状态 ,再与 5 Fu 合用,建立免疫抑制模型。
常用的有丝分裂原刀豆蛋白
A(ConA)和细菌脂多糖(LPS)分别刺激T淋巴细胞和 B 淋巴细胞增殖 , 为考察样品对不同淋巴细胞亚群的影响 , 本试验选用ConA和LPS两
种工具药，建立体外拮抗化疗药物免疫抑制作用的筛选模型。
该模型的建立为从多糖中开发辅助化疗的药物奠定了基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1样品来源
供试样品均为本研究室分离纯化得到的多糖。
其中 FB1 为灰树花 (Grifola frondosa) 子实体中分离获得 ( 制备方法见文献[9]),F1 1 为龙须菜 (Gracilaria lemaneiformis) 中分离获得 ( 制备方法见文献 [10]),BW 、glpds1a 、19号为灵芝 (G. lucidum) 沪
农灵芝1号子实体中分离获得(BW制备方法见文献 [11],glpds1a 、 1 9制备方法见文献 [12]) 。
刘艳芳, 等: 拮抗化疗药物体外免疫抑制模型的建立及活性成分筛选
1.1.2实验动物
BALB/c 小鼠, C57BL/6j 小鼠, 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号为SCXK沪)2007 0005,8〜12周龄，体重20〜 25 g, 雌雄不拘。
1.1.3试剂与仪器
刀豆蛋白A(ConA)、细菌脂多糖(LPS)、5氟尿嘧啶(5 Fu)
均购自 Sigma 公司;Alamar Blue Assay kit 购自 Biosource 公
司;RPMI1640培养基、0.25%胰蛋白酶、台盼蓝、胎牛血清（FBS）
购自 Gibco 公司 ; 青霉素和链霉素购自 Amresco 公司 , 其它试剂
均为国产分析纯试剂。
Coulter Z series 细胞计数仪（Coulter Electronics 公司）,Synergy HT酶标仪（BioTek 公司）,CO2 培养箱（Thermo Forma 公司）, 倒置显微镜（Olympus 公司）。
1.2 方法
1.2.1 试剂配制
RPMI1640培养液:取RPMI1640培养基粉末一包，用无菌超纯
水定容至1 L,待粉末充分溶解后，加入NaHCO3 2 g,同时分别加入青霉素和链霉素至其浓度为30卩g/mL和100卩g/mL,用NaOH
调节pH至7.2,过0.22卩m滤膜后分装，于4C保存，使用时加入10%灭活的胎牛血清。
红细胞裂解溶液:9 X NH4Cl溶液（w/v=0.83%）与
1 X Tris -HCl （w/v = 2.06% ,pH 7.65）混合，用 6 mol/L 盐酸调节pH至7.2。
1.2.2 小鼠脾淋巴细胞的分离制备
小鼠脾淋巴细胞的分离制备方法同。