高通量药物筛选模型* 姚佳 杨建波 杨洁* （南京大学生命科学院生物化学系，医药生物技术国家实验室，南京210093）
摘要： 本文介绍了可用于药物筛选的三种新的快速高通量筛选方法，包括基于反酵母双杂交的筛选系统；细胞平台伤的高通量筛选系统以及动物水平的筛选系统。并对其应用原理，应用情况和有缺点进行了阐述。 关键词： 高通量筛选（HTS），酵母双杂交，靶点，受体 Abstract: This article mainly deals with three new dominant plat forms of HTS(High-Throughput Screen) which are fairly useful in drug screen——the reverse yeast two hybrid system, the cell-based screen and the animal platform, including their principles, their appliance and their advantages together with disadvantages. Key Words: High-Throughput Screen, yeast two-hybrid system, target, receptor 学科分类号：Q7
药物筛选模型研究经历了三个不同的发展阶段：最初意义上的筛选方法、分子生物学筛选方法和高通量筛选方法，而每一个阶段都源于一种新技术的诞生。最初的药物筛选是直接利用动物组织或天然产物进行的，并不涉及到疾病发生的分子机制。在这样粗略的筛选系统中只有有限的样品得到筛选，而且大多数样品只是基于疾病表征而非靶点的筛选。因此，药物的发现会带有偶然性。1980年以来，随着有机化学和分子生物学的发展，更加系统化的筛选方法应用到药物研究与开发中。一方面，有机化学的飞速发展为筛选提供了庞大的人工合成小分子库；另一方面，分子生物学为筛选提供了靶蛋白。通过比较正常人群与疾病患者间在机体组织细胞分子上的差异以及阐明模型组织中相应蛋白质的功能，从而正确地选择、描述并确认某些靶蛋白，有助于更加理性地进行药物筛选，不足的是上述过程往往费时耗财。而基因组学的发展对这个问题提供了很好的解决方法，基因组学能够更加有效地验证潜在的靶蛋白,并通过功能基因组研究能够快速有效地确认与特定疾病有关的靶蛋白[ 1 ]。
* 本课题为国家自然科学基金资助项目（项目编号30171094和30271497）。联系人：杨洁，南京大学生命科学学院，医
药生物技术国家重点实验室，南京210093，中国；电话：86-25-3594060，传真：86-25-3324605；Email：luckyjyj@sina.com。 传统意义上的药物筛选方法一般包括精确定义某些具有选择性的靶蛋白、确定其中某些靶蛋白的生物学性质以及体外药物筛选[ 2 ]。而基于化学基因组学的药物筛选则包括从基因角度广泛地确定靶蛋白，对其中的大部分靶蛋白进行高通量的化合物筛选，对其中有希望的化合物进行生物活性检测。使用该方法的优势在于能够提供更多的靶蛋白数据以利于进行庞大的化合物库的筛选，从而能够提高活性化合物的发现几率。 由于组合化学和化学基因组学的迅猛发展，为药物筛选提供了大量的化合物库以及更多的靶点，这必然要求有高效快速的方法进行药物筛选，高通量筛选系统（High-Throughput Screen System，HTS）的出现给药物研究者提供了一个快捷的途径。目前高通量筛选技术呈多元化发展趋势，可在以下三种平台上进行，即酵母平台、细胞平台和动物平台。本文主要介绍这些模型的原理及其应用。 1 基于反酵母双杂交系统的药物筛选模型 酵母反双杂交系统是从酵母双杂交系统发展而来的新型药物筛选系统。酵母双杂交系统在研究蛋白----蛋白相互作用方面已经成为一种成熟有效的遗传学方法[ 3 ]。其理论依据是，许多序列特异性的转录因子通过结合到DNA上游激活序列（UAS）并在相应的启动子部位激活RNA聚合酶II从而提高靶基因底转录效率。DNA结合和激活功能定位于2个互相分离的结构域内，分别称为DNA结合结构域（DB）和DNA激活域（AD）。与转录因子无关的蛋白与蛋白间相互作用使得DB和AD在空间上相互接近，从而重组形成一个有功能的转录因子。因此，有功能转录因子的重组可以总结为DB－X和AD－Y，其中的X、Y可以是来自任何组织的蛋白质分子。将酵母生长标记例如LEU2或者HIS3（分别参与了亮氨酸和组氨酸的合成）置于含有DB结合位点的启动子控制下，则DB－X与AD－Y的相互作用会产生选择性生长优势，从而在缺乏特定氨基酸的培养基上呈现小的菌落[ 4 ]。据此可以确定大量蛋白间的相互作用。 反酵母双杂交是基于酵母双杂交基础上的一种新型的药物筛选方法。其理论基础与酵母双杂交基本相似，区别在于其报告基因不同，反酵母双杂交系统中只有在蛋白间相互作用被阻断时能够显示出选择性的生长优势。在反酵母双杂交模型中，野生型DB－X与AD－Y的相互作用将会导致对酵母细胞的细胞毒或者致死作用，因为在这个系统中报告基因是一些毒性标记基因例如URA3（负选择）[5]。在这个模型下，DB－X与AD－Y的彼此分离能够促成生长优势，从而能够很方便的验证一些相互作用缺陷型的等位基因或者一些阻断相互作用的小分子药物或者小肽（图1）[ 2 ]。 图1双杂交系统原理示意图。(a)--正向的双杂交系统 (b)--反酵母双杂交筛选 目前已经有多例成功报道，例如利用反酵母双杂交系统从人工合成的小分子库中筛选出了一些具有钙离子通道阻断活性的小分子[6]。在这里，N型钙离子通道的两个亚基β3和α1B-I-II胞内loop被分别融合到反酵母双杂交系统中的Gal4 DB和Gal4 AD中。利用CYH2作为负选择筛选标记，该基因的启动子中包含有Gal4结合位点。在含有放线菌酮的培养基上，如果该报告基因表达将会导致酵母细胞中毒死亡。利用该系统在含有156000个化合物的组合化学分子库中进行高通量筛选，发现其中有10个小分子显示出具有挽救放线菌酮敏感型的DB－β3与AD－α1B表达细胞的活性，获得了一个较好的抑制N型钙离子通道的活性小分子，并有可能发展成为一类新型的、有潜在治疗意义的钙离子通道拮抗剂。 反酵母双杂交系统作为一种理想的高通量筛选系统，具有以下优点：1）该系统中的酵母细胞能够繁殖，因此无需对靶分子进行耗时耗力耗财的生物纯化过程，而且能够在相对短时间内对大量的蛋白质进行测试。2）该系统是在一个生物体环境内进行的，因此与体内环境较为接近。细胞通透性以及细胞毒作用都作为参数在筛选过程中考虑。而这一点恰恰可以弥补体外筛选实验的不足。3）基于该系统的筛选能够比较准确地分析蛋白间的相互作用。利用几乎完全相同的步骤，不相关蛋白间的相互作用也可以进行测试。这就意味着许多蛋白间相互作用能够同时进行。4）该系统能够与现有的高通量筛选兼容，从而可以在96或384孔板上测试组合化学分子库中的化合物。另外它还很容易与计算机工作站等相结合，从而能够快捷地分析实验数据。 尽管反酵母双杂交系统作为一种理想的高通量筛选模型，具有很好的前景，但仍然存在一些缺陷，例如细胞膜通透性问题以及对药物浓度要求较高往往超出了组合化学所能提供的浓度等。目前正在进行多种尝试以改进这些缺陷，如通过改变酵母的基因型从而提高细胞膜的通透性[ 7]，取得较为理想的效果。 2 基于细胞平台的药物筛选模型 与酵母系统相比较，细胞平台的药物筛选系统可以直接选取来源于人源组织的细胞或者是人源转化细胞株进行培养，更接近人体的情况，从而能够改善一些蛋白靶点在异源细胞中表达情况不够理想的局面。基于细胞的高通量筛选，能够提供化合物对于特定受体、离子通道或者是细胞内的药理活性，而传统的生化分析往往不能得到这些活性数据。例如细胞平台上的高通量筛选能够区别药物究竟发挥激动剂作用还是拮抗剂作用或者是别构调节作用。同样，细胞平台的HTS也能够提供有关药物膜通透性以及毒性方面的信息[ 9-11 ]。细胞对于各种刺激能够产生显示的功能，例如基因转录、离子通道的开关、细胞增殖、细胞毒性、分泌、蛋白表达、酶活性改变等。这些性状的改变为检测提供了很好的目标。细胞平台上的高通量筛选过程如图2[8]所示。
图2细胞平台上的高通量筛选主要过程的示意图 目前基于细胞的高通量筛选经常采取三种以下方法。
2、1 特定启动子操纵的荧光素酶报告基因 在20世纪80年代，一些科学家就利用一些报告基因研究cDNA的5’端非翻译区，以确定参与基因转录调节的序列位置。在随后的时间里，更多的报告基因被用于细胞平台上的高通量筛选如G蛋白偶联的受体（GPCRs）、受体激酶以及核受体等。报告分析将一些靶点的生物学活性与一系列已确认的酶或者蛋白质表达相偶联，如氯霉素转移酶、荧素酶、分泌型生长激素、β-半乳糖苷酶、分泌型碱性磷酸酶、荧光蛋白、β-内酰胺酶等等。这些酶或者蛋白提供了一个高度放大的信号，从而保证了系统的灵敏度。其中荧光素酶是高通量筛选最常用的报告酶类。在该系统中，将待研究基因的启动子或者启动子的部分元件与报告基因的编码区相连接。如果将一个合成的重复特定反应元件插入到报告基因的上游，还可以实现让该途径产生的信号分子对自身途径进行调节。 该系统中一个成功的例子是在单核巨噬细胞中有特定启动子驱动的荧光素酶报告基因表达[ 12 ]。该系统对于背景噪音信号具有很好的控制效果，而且对药物激动剂显示出计量效应；同时该系统对显示出对DMSO（二甲亚砜）溶液高度的耐受性，并且能够产生稳定的信号。 但是当化合物所表现出来的抑制剂活性与所设想的曲线相一致时，可能会产生假阳性。同时，若化合物具有细胞毒性也会导致假阳性。另外，对靶点远程的非特异性作用或者同一细胞内其他启动子对报告基因都会有干扰作用。GPCR靶点的信号反应往往需要4-5小时，因此不能用于快速细胞反应的筛选并且很有可能对弱相互作用具有屏蔽效果。 2、 2 GPCR-FLIPRtm-Ca2+反应系统 这是一种监测受体的信号转导途径的筛选系统，通常用来直接测量受体介导的cAMP的聚集作用，或者通过测量细胞内Ca2+ 浓度的变化情况来判定GPCR途径的活化与否[ 13 ]。在该系统中，通过Gq蛋白偶联的GPCR靶蛋白能够使细胞内的Ca2+ 浓度明显上升，并且通过Ca2+ 浓度敏感型的染色剂进行测定。FLIPRtm 是一种高灵敏度的信号收集器，该系统能够区别某些针对受体的微小作用，例如区别激动剂、别构调节以及抑制剂活性。缺乏受体或者G蛋白的细胞即使在使用激动剂时依旧不能产生可检测的Ca2+ 反应。该系统也显出对化合物的剂量依赖性。同样这个系统也有所缺陷，例如Ca2+ 以及一些能够穿过细胞膜的化合物会导致激动剂筛选的假阳性也会干扰抑制剂分析。此外一些细胞即使没有G蛋白，其内源性的其他受体也可以通过Gq蛋白进行偶联，诱导Ca2+ 反应从而表现出激动剂活性或者对抑制剂活性筛选产生干扰。 2、 3 转运蛋白－放射性配体摄取测定 当细胞转运蛋白与配体的结合非常复杂时，往往倾向于采用这一系统，例如针对氨基酸和神经递质的载体靶蛋白的筛选。该系统尤其适用于在结合分析中容易被忽略的变构调节作用。基于该系统的筛选分析常常是短时效分析，一般时间在60－90分钟左右，因此化