微生物学大实验实验指导编者：生物技术教研室2007.3目录实验一酵母菌的培养与分离‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2 实验二酵母菌的鉴定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7 实验三酵母菌耐受能力的测定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19 实验四酵母菌发酵工艺条件的优化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥22 实验五耐高温酵母菌株的诱变选育‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24 实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥27耐高温酒精酵母菌的选育及发酵条件的研究实验一酵母菌的培养与分离一、实验目的学习培养和分离酵母菌的技术和方法二、基本原理大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5－6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。

酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。

利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。

三、实验主要内容和要求（一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验包括：1．马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液的配制。

2.菌株的筛选,根据一定的生产目的并从特定的样品筛选出高产酒精的适宜的酵母菌株。

3.酵母菌的分离,要求接种一次, 28-30℃，培养24小时，转接一次，28-30℃，培养24小时，并用镜检的方法独立判定所分离菌株是否为酵母菌。

4.用划线分离法对酵母菌进行纯化，要求每组挑取单个菌落，连续划线分离4代，镜下为单一纯菌株，每组扩繁10支斜面菌种，备用。

四、实验的准备1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1%美蓝染液、1ml的无菌吸管、无菌培养皿等。

2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：原料：马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）。

配制方法：（1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml ，制成20%的马铃薯汁。

（2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115℃条件下高压灭菌20分种。

（3）加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，但不加琼脂而加乳酸，按每1000ml培养液中含5ml乳酸的量加入，并分装试管。

五、实验设计l、接种：取一小块果皮，不需冲洗，直接接入乳酸马铃薯葡萄糖培养液管中，置28-30℃，培养24小时，可见培养液变混浊。

2、培养，用无菌吸管取上述培养后培养液0.lml，注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28一30℃再培养24小时或稍长(过长则霉菌长出)。

3、观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。

活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。

4、分离：马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板。

用划线法分离酵母菌培养液，从而得到单个菌落。

挑取单个菌落反复再次划线分离纯化，最终可获得纯培养。

六、实验注意事项1.配制培养基时，应注意琼脂的加量，不同规格及批次的琼脂的加量应由实验确定，不能照搬书上的加量。

2.对培养基加热时应注意琼脂的糊底与暴沸。

3.灭菌锅操作时，首先应注意水一定要加足够，排气要彻底，其次灭菌期间不要离开人，灭菌结束后，关闭电源，拔掉插头，最后放气一定要缓慢，均匀，气放彻底才能开锅，取锅内物品，应小心，防止烫伤。

4.接种前应注意无菌工作台的消毒与杀菌，接种时应注意手与接种工具的消毒。

七、实验结果的观察及记录1.24小时，观察试管内培养液的情况并作记录，每组转接2支试管。

2.48小时，观察试管内培养液的情况，镜检培养液内菌的数量，粗略判断是否为酵母菌并作记录，每人蘸取培养液进行划线分离，并作记录。

3.72小时后，观察培养皿内菌的生长的情况，挑取单个菌落进一步划线分离，直到为纯菌落。

4.每组转接10支斜面试管，备用。

八、实验的延伸自然条件下酿造苹果酒，葡萄酒、猕猴桃酒。

七实验报告要求1.实验完毕后，每位同学都应独立作出实验报告，实验报告应类似于小型论文格式。

2.实验报告内容包括：（1）立题意义。

（2）实验设计。

（3）实验步骤详细记录。

（4）对实验结果的分析讨论和总结。

（5）实验延伸。

（6）实验心得体会。

附1：果酒的酿制方法—、目的要求了解果酒酿制原理，学习苹果酒酿制技术。

二、基本原理果酒是一类营养丰富、含酒精度低的上乘饮料。

它是用含一定糖分和水分的果实压汁，经微生物发酵而成。

其生化作用，除酒精发酵的主产物外，还有甘油、醋酸、琥珀酸、杂醇油等的形成；同时，陈酿期中，各种酸类与醇类的酯化反应，赋予果酒特殊的香味；果酒中的单宁、色素、果屑微粒及蛋白质（包括酵母尸体）等的氧化和下沉，使酒液澄清、风味增浓。

各种果酒以原料而称名。

除坚果外，所有栽培果，野生果均可做酿果酒的原料。

本实验以苹果酒为例，学习其酿制方法。

三、实验材料1、菌种在7°Be’麦芽汁琼脂斜面培养基上的葡萄酒酵母（s.cerevisae ellipsoieleus）。

2、器材苹果汁培养基，7°Be’麦芽汁培养基，10ml／管、100ml／三角瓶等装量，白糖，食用酒精，亚硫酸，果胶酶，发酵缸，破碎机，果汁分离器等。

a.苹果汁培养基粗滤新鲜果汁（蔗糖调至13°Be，酸度0.5%以下）1000mlK2HPO4 0.1g MgSO4·7H2O 0.1g配好后，加热煮沸3～5分钟，静置10小时以上，过滤、分装，0.7Kg／cm2灭菌20分钟。

四、实验步骤（一）酒母培养1、菌种活化（一级种）取装有10ml苹果汁或7°Be’麦芽汁培养基1支，按无菌操作法接种葡萄酒酵母菌一环，混匀后置28～30℃下培养2～5天（用苹果汁活化菌种时需培养5天以上），镜检酵母繁殖良好，无杂菌即可。

2、母发酵剂制备（二级种）在装有100ml苹果汁培养基的三角瓶中，接1～2ml 经活化的葡萄酒酵母菌液，于28℃下培养2～3天，当培养液表面有气泡产生，嗅之有酒香味、取样镜检无杂菌时使用。

3、生产发酵剂的制备（三级种）方法与母发酵剂相同，只是采取更大的容器。

一般采用500～1000ml的三角瓶或卡氏罐，盛装占容积1／2～3／5的果汁培养液，灭菌冷却后，按10％接种量接人母发酵剂，在25～28℃下培养24～48小时，待发酵正常，镜检无杂菌方可使用。

4、如果使用活性干酵母，添加量为20g/L发酵醪，复水用水量是干酵母重量的5～10倍。

复水用水的温度应保持在40℃左右（38～43℃），将酵母静置5～10min后搅拌，酵母在水中的时间不能超过30min。

然后使酵母溶液缓慢冷却到与将被接种发酵醪的温差小于10℃，然后直接加入发酵醪。

（二）果酒生产工艺流程如下：果胶酶↓苹果→分选除杂下清洗→破碎→压榨→粗果汁→果楂、苹果酸、丹宁↑活化酵母→母发酵剂→生产发酵剂↓蔗糖→发酵→皮渣分离→后发酵→原酒→→换捅除渣→贮存陈酿→配制→贮存→澄清过滤→装瓶→巴氏灭菌→封口→成品。

(2～3次)操作要点：1、分选取成熟苹果，除去腐烂、干疤和伤果。

2、清洗清水充分洗涤，除去果皮上的污物、杂质及药剂，以保证原料干净卫生。

3、破碎为易于压榨，提高出汁率，需进行破碎。

用破碎机破碎至果块粒度0．5cm3左右，并除去果籽。

4、压榨分离破碎后立即进行压榨分离。

分离出的果汁中不得夹带果肉，同时需添加适量苹果酸调整含量（要求果汁总酸含量为5g／L），并加入0.1～0.15g／L的果胶酶，促进果胶分解，使果汁澄清并提高酒的风味。

由于苹果汁易被自身含有的多酚氧化酶氧化，故需加SO2还原剂抑制酶活性，同时SO2也具有杀菌、防腐和澄清果汁作用。

SO2来源，除工厂应用液态SO2外，实验室常加入亚硫酸钠（Na2SO3）和偏重亚硫酸钾（K2S2O5），其用量为果汁量的0.02％即可。

5、前发酵取澄清果汁放入经干热灭菌的发酵缸中，装量占缸容积的4／5，按3～5％的接种量接入酵母生产发酵剂进行发酵，保持品温在18～22℃之间，最高勿超过25℃，发酵应在7～12天内结束。

一般苹果汁糖分约为11％，经发酵后，酒精含量约达6％以上，前发酵结束后，原酒酒度应大于8％（V），残糖＜20g／L，总酸（苹果酸）＞5g／L。

6、后发酵前发酵结束后，迅速将酒液与皮渣分离，酒汁转入经干热灭菌的发酵缸中，进行后发酵，使残糖继续分解。

期间，控制品温在18～22℃之间，不要超过25℃，时间1个月，即得原酒。

要求残糖含量小于2g／L以下，挥发酸（以醋酸计）小于0.6g ／L，总酸（以苹果酸计）大于5g／L。

7、换桶除渣为使已澄清的原酒与其酒脚（沉淀物）及时分离，以免酒脚产生异味而影响酒质，故需进行换桶（缸）。

换桶次数新酒每年换三次。

8、贮存陈酿应满桶贮存。

陈酿即酒的老熟，经长期密闭贮存，可使酒质澄清、风味醇厚。

贮存室温8～16℃，存期半年以上。

9、配制原酒贮存半年后可开始配制。

配制时，按工艺规定将不同原酒按一定配比相混，然后添加适量的糖、酒精、继续贮存半年以上。

10、澄清过滤可采用冷冻法使其澄清，即于-4℃左右存放7天，然后冷过滤。

澄清后的酒置-5～-7℃下冷冻3天不发生混浊沉淀，或暴露空气中氧化4天不变混浊即为合格。

11、装瓶灭菌装瓶后需进行巴氏灭菌，即在63℃下处理15分钟，冷却后封口保存。

五、实验报告1、简述苹果酒的酿制法。

2、二氧化硫在果酒酿制中的作用是什么？六、思考题1、酵母菌酿酒的原理是什么？2、果酒酿制中为何要加入果胶酶？实验二酵母菌的鉴定酒精生产中所用酵母菌在微生物学中的分类依据是什么?微生物学的类别分门、纲、目、科、属、种，生产酒精用酵母菌属于微生物中的真菌门、子囊菌纲、原子囊菌亚纲、内孢霉目、内孢霉科、啤酒酵母属、卡尔斯伯酵母属等。

酵母菌的分类依据是根据它的形态特征、生理生化反应特征来确定的。

在分类前将菌体细胞进行分离纯化，得到由单细胞长成的菌落，然后再进行形态特征和生理生化鉴定。

(一)形态特征的鉴定把酵母菌接种到麦芽汁固体培养基上，让它长成菌落，观察其菌落的形态、颜色、质地、边缘、表面等特征。

把它再接种到液体麦芽汁培养基中，观察是否能产生醭、试管或培养仪器表面壁上能否形成菌环，培养液中是否产生沉淀、混浊程度等。

另外，还要取样在显微镜下观察其单细胞的形态、大小、能否形成孢子、孢子的大小以及繁殖方式等。

(二)生理生化特征的鉴定酵母菌的生理生化特征主要表现为发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等糖类的能力。

同时，还需测定利用其它碳水化合物、同化酒精、耐酒精，利用硝酸盐还是硫酸盐，发酵产酸、产醋、耐温、耐酸、抗重金属离子、抗杂菌性等的能力。