举例：
扇贝多肽（PCF）对UVB诱导 的HaCaT细胞FADD蛋白表达 的影响。FADD蛋白表达水平 以FADD与β-肌动蛋白（内参） 吸光度比值表示。
高效液相色谱仪
高效液相色谱分离是利用试样中各组分在色谱柱中的淋洗液和固定相间 的分配系数不同，当试样随着流动相进入色谱柱中后，组分就在其中的两 相间进行反复多次（103-106）的分配（吸附－脱附－放出），由于固定 相对各种组分的吸附能力不同（即保存作用不同），因此各组份在色谱柱 中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序离开色谱柱 进入检测器，产生的离子流信号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色 谱峰。
脱脂奶粉（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液 ） BSA(牛血清白蛋白） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）
六、一抗、二抗孵育
把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入一抗溶液 与滤膜温育，4℃过夜。
倒掉一抗溶液，用PBS漂洗滤膜3次，每次10min。 加入配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 室温一小时或4℃
标本制备 二聚体/多聚体存在：使用还原变性电泳，除非说明书上有特殊说明 多个亚型存在？（Isoforms） 蛋白降解？ 蛋白修饰
Western blotting 结果如图所示，FADD对照组有低表达，模型组表 达量明显增加，与模型组相比，各剂量PCF组FADD表达量均降低 （P<0.01），且随PCF剂量增加对FADD表达量抑制作用逐渐增强， 呈剂量相关性。
SDS是一种阴离子表面活性剂， 能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例 和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷， 掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
聚丙烯酰胺凝胶内部有大小不一的孔径，使得小分子快速通过，大分子受小孔 径阻挡跑的慢，从而形成跟分子量有关的梯度条带
蛋白样品的制备
（蛋白抽提、定量）
SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳
（SDS-PAGE凝胶制备、 上样）
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
➢ 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0 ，也可向公司购买。
的二抗。
➢ 二抗的使用：
根据说明书推荐浓度使用TBST稀释二抗。 如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索
最佳稀释度（1:1000-1:20000）。 孵育条件一般为室温1-2小时。
Santa cruz, Cell signaling, Invitrogen, Sigma, Abcam, R&D, Abnova, Chemicon, Calbiochem, Millipore, BD, Cayman, Roche, eBioscience, et al.
保持色谱柱的稳定性，因而：
1) 与固定相不互溶
（延长柱寿命）
2) 不发生不可逆吸附
3) 有合适的pH值
化学惰性—不与样品及固定相发生反应。
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适用于所选的检测器
1) UV： 在紫外线区“透明” 2) 示差：折射率与溶剂有较大差异 3) 电化学检测器：电惰性。 对样品有很强的溶解力。
制作标准曲线 （插入表格）
检测样品蛋白含量：取一管考马斯亮蓝+95 l 0.15mol/L NaCl
NaCl溶液+5l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入比色杯中测试。
20-30 ug 细胞/组织裂解物 100 ng 纯化蛋白
根据蛋白表达丰度调整适当的蛋白上样量 上样量一致：每孔上样量保持一致 上样前用loading buffer加热变性样本
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1类 脂肪族醚，三级烷胺 2 脂肪醇 3 四氢呋喃,吡啶,二甲基甲酰胺,二甲亚砜 4 乙二醇,乙酸,甲酰胺 5 二氯甲烷,1,2-二氯乙烷
6 乙腈,乙酸乙酯,二氧六环 7 苯,甲苯,二甲苯,硝基甲烷,硝基乙烷,甲乙酮 8 氯仿,水
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过夜。 倒掉二抗溶液，用PBS漂洗滤膜3次，每次10min。
七、二抗与底物反应显色
ECL化学发光显色液
比较常用，结果容易控制，但是被催化是 灵敏度差一点
DAB显色液
比较灵敏，是HRP最敏感的底物
常用的有PVDF膜，硝酸纤维素膜或者尼龙膜
BSA或者脱脂奶粉(光明脱脂奶粉) 商业化的封闭试剂
高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱 柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高 压。一般可达150～350×105Pa。 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10 ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少 得多，一般少于1h。 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步 提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外， 用样量小，一般几个微升
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝 酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起 免疫反应。
再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或 放射自显影以检测特异性目的基因表达的蛋白成分。
➢ 有机溶剂提取法
对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。
原理—考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙
醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物， 该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低 成正比 。
Santa cruz, Cell signaling, Invitrogen, Sigma, Abcam, R&D, Abnova, Chemicon, Calbiochem, Millipore, BD, Cayman, Roche, eBioscience, et al.
➢ 二抗选择：根据一抗来源种属以及抗体Ig亚型选择合适
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检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化 为可供检测的信号，常用检测器有紫外吸收、荧光、示差 折光、化学发光等。
紫外可见吸收检测器（UVD）是HPLC中应用最广泛的 检测器之一，几乎所有的液相色谱仪都配有这种检测器。
荧光检测器是一种高灵敏度、有选择性的检测器，可检测能 产生荧光的化合物。某些不发荧光的物质可通过化学衍生化 生成荧光衍生物，再进行荧光检测。
显色底物：操作简单，灵敏度低，如TMB、
DAB、BCIP/NBT
化学发光底物：灵敏度高，需要曝光检测设
备（暗室、曝光设备和胶片）或者凝胶成像设 备。没有信号 背景 非特异性条带 条带大小不对
标本问题 标本中不含检测蛋白：设置阳性对照 上样量不够，或者蛋白表达丰度比较低：增加上样量 转膜问题
高效液相色谱仪在医药方面的应用
① 分离分析药物的组分含量 ② 药物生产中进行中间控制 ③ 分析药物在体内的残量 ④ 测定药物在各种器官中的代谢产物，特别是研究药物的代谢 产物在血清中存在的情况。
HPLC特点
采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器。 高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便。
四、Western Blot 转膜
分离的蛋白通过电转膜方式从凝胶中转移到杂交膜上 （PVDF或NC膜）：在之前需要“切胶”
PVDF膜：可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较 强，但价格比较昂贵。
NC膜（硝酸纤维素膜）：价格比较便宜，应用较广，结 合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋 白吸附容量高，亲水性较好。
医学机能实验学常用仪器介绍
1 蛋白印迹（Western blot） 2 高效液相色谱仪
3 其他相关技术和仪器的介绍
Western Blot中文一般称为蛋白质印迹
通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到 杂交膜上
分离的蛋白可以通过一抗/二抗复合物进行检测
是蛋白质分析的最流行的技术之一
它采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质， “探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
清洗与更换方便：可减少更换溶剂时的间隔 时间。
低价、毒性小、纯度高。
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1) 有合适的理化性质（沸点、粘度等，尽可能小 一些）
2) 合适的强度（分配系数要合适，简单样品可大， 复杂样品要小）
3) 混合溶剂（有等度和梯度之分）
4) 极性合适（需根据溶剂的性质而定）
封闭 封闭时间不够：延长封闭时间 优化封闭试剂的类型和浓度 封闭试剂和抗体有交叉反应：更换封闭试剂. 磷酸化抗体不能使用含有酪蛋白的封闭试剂：推荐BSA封闭
抗体孵育和检测 一抗/二抗浓度太高：降低抗体浓度 孵育温度太高：建议4度孵育过夜
其他 洗膜不充分：5*3mins，多次短时间的洗膜 曝光时间过长：缩短曝光时间 出现干膜现象：保证膜充分浸透，避免出现干膜 二抗非特异性：设置只加二抗对照
举例
应用高效液相色谱方法检测人血浆和尿液中左卡 尼汀(L-carnitine，LC)及其酰化物乙酰左卡尼汀 (Acetyl-L-cainitine，ALC)、丙酰左卡尼汀 (Propionyl-L-cainitine，PLC)含量
转膜不完全：转膜后使用丽春红染色，确定目的大小蛋白条带是否存在于膜上，使 用蛋白质Marker.