表面等离子体共振传感器程玉培 1433591摘要:表面等离子体子共振(SPR) 技术是一种简单、直接的传感技术。

它通过测量金属表面附近折射率的变化, 来研究物质的性质。

表面等离子体子共振传感器已经成为生物传感器研究领域的热点。

关键词表面等离子体子共振传感器生物分子间相互作用前言生物化学是运用化学的理论和方法研究生命物质的边缘学科。

其任务主要是了解生物的化学组成、结构及生命过程中各种化学变化。

化学的核心是化学键，即分子间的相互作用，而要研究生命过程中的各种化学变化，归根到底就是要研究生物分子之间的相互作用。

生物分子之间的相互作用是生命现象发生的基础，研究生物分子之间的相互作用可以阐明生物反应的机理，揭示生命现象的本质。

近年来，研究生物分子之间相互作用的技术不断出现，其中表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）在生物学以及相关领域的研究应用取得了很大进展，SPR技术可以现场，实时地测定生物分子间的相互作用而无需标记，可以连续监测吸附和解离过程，并可以进行多种成分相互作用的研究。

1 表面等离子体共振传感器概述1.1 表面等离子体共振传感器简介表面等离子体子共振( surface plasmon resonance , SPR) 是一种物理光学现象。

利用光在玻璃界面处发生全内反射时的消失波, 可以引发金属表面的自由电子产生表面等离子体子。

在入射角或波长为某一适当值的条件下, 表面等离子体子与消失波的频率和波数相等,二者将发生共振, 入射光被吸收, 使反射光能量急剧下降, 在反射光谱上出现共振峰(即反射强度最低值) 。

当紧靠在金属薄膜表面的介质折射率不同时, 共振峰位置将不同。

1.2 表面等离子体共振传感器研究背景及现状表面等离了体共振效应的发现可以追溯到上世纪初。

关于SPR效应的最早记载是源于1902年Wood发现光波通过光栅后，光频谱出现小区域内的能量损失现象。

1941年，Fano针对这一现象根据金属和空气界面上表面的电磁波理论和边界条件进行了详尽的解释。

1957年，当高能电了通过金属薄膜时，Ritchie发现能量损耗不仅发生在体积等离了体频率处，在更低频率处也发生了，于是认为这与金属薄膜界面特性有关。

1958年，Turbader为了观察SPR现象，对金属薄膜采用光的全反射激励的方法。

1960年，Stern和Farrell首次提出了表面等离了体波（Surface Plasmon Wave，SPW）的概念，并对这种谐振模式产生的条件进行研究。

同年Raether又专门详尽描述了SPR共振效应在不同表面上的激励特性。

1968年，经过多年的研究德国物理学者Otto认为表面等离了体共振效应的实质就是一种光学全反射的现象，既衰减全反射（ATR），并据此设计了以棱镜为基体的Otto模型同时给出SPR激发条件。

1970年，另一位德国的物理学者Kretschmann提出一种新的粗糙表面扰动理论，设计了一种新的Kretschmann模型，与Otto模型相等价。

该模型较之Otto模型具有加工更方便、准确度更高的优势，之后很多学者的改进和应用都在该模型的基础上进行的。

表面等离了体波传感器的生产与应用能拥有如此广阔的前景也是由于该模型的出现。

20世纪70年代到80年代，随着Kretschmann模型的广泛和深入研究，它的潜在价值逐渐发挥出来。

棱镜SPR传感器作为一个基于此模型的新生产物，具有灵敏性高、特异性好、免标记的特点。

1982年，Nylander和Lieberg首次将棱镜SPR传感器作为化学传感器用于气体的检测。

1983年，作为生物传感器瑞典学者Liedberg首次成功检测了IgG蛋白质与其抗原的相互作用的反应过程[1]。

1987年，Cullen等人首先将光栅激发表面等离子体技术应用于传感。

1990年，瑞典的Biacore AB公司开发出第一款商用化SPR仪器。

1993年，美国华盛顿大学Jorgenson首先提出了在线传输式和终端反射式这两种光纤SPR传感器。

此后，SPR传感器的研究和应用开始全面展开，相关的文献报道每年成倍地增长。

1995年关于SPR研究的文献只有30多篇，1998年则增长到近300篇，1998至2000年的二年时间里，应用SPR技术发表的文章已经超过1500篇，直至目前为止，利用该技术发表的文章已经超过了5000篇，可见SPR传感器已经成为目前国际上光化学传感器研究领域的前沿[2]。

随着SPR技术在不同领域应用研究的开展，形成了一系列新的热点方向。

光纤SPR传感器具有结构灵活、体积小、可集成、可远程在线实时监测、易于实现分布式传感等优点，在活体探测，野外环境监测等领域的应用具有独特的优势，不断有文献报道各种新型的光纤SPR传感器，如通过对光纤进行拉锥、侧面抛磨、出射端几何结构改造和利用光纤光栅等手段制作而成的光纤SPR传感器。

利用金属光栅、纳米金属粒子阵列等金属微纳结构局域表面等离子体共振产生的高场局域性，可以有效提高SPR传感器的灵敏度、选择性、空间分辨率、可集成性，成为近年来探测传感领域研究和应用的又一个重要方向。

通过将金属微纳结构与传统SPR结构结合起来，利用LSPs与SPs的相互作用，可以有效增强探测信号。

另外，将金属微纳结构与光纤、平面波导技术相结合，易于实现集成化，可大大扩展金属微纳结构表面等离子体共振传感器的应用范围。

现代生物技术的研究发展，对发展高通量、多组分、实时快速检测和分析的需求日益迫切。

表面等离子体共振成像技术（surface plasmon resonance imaging，SPRI），不仅能有效提高SPR传感器的测量速度，还能更为直观、实时地监测分子相互作用动力学过程，是目前SPR传感器研究的又一热点。

最新文献还报道了利用金属光栅结构制作的表面等离子体共振成像芯片进行生物分子相互作用检测的实验[3]。

1.3 表面等离子体共振传感器的原理[4]1.3.1 消逝波从菲涅尔定理（n1sinθ1=n2sinθ2）可以看出，光从光密介质入射到光疏介质时（n1>n2）就会产生全反射现象。

但从波动光学的角度来分析，全反射的光波会透过光疏介质约为光波波长的一个深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质。

光的总能量没有发生改变。

透入光疏介质的光波称为消逝波。

消逝波在界面的传播如图1-1所示。

图1-1 消失波在界面的传播1.3.2 表面等离子体波当金属受到电磁干扰时，金属中的电子密度分布就会变得不均匀。

设想在某一区域电子密度低于平均密度，那么就会形成局部的正电荷过剩。

这时由于库仑引力作用，会把近邻的电子吸引到该区域，而被吸引的电子由于获得附加的动量，又会使该区域聚集过多的负电荷，然而，由于电子间的排斥作用，使电子再度离开该区域，从而形成价电子相对于正电荷背景的起伏振荡。

由于库仑力的长程作用，这种局部的电子密度振荡将形成整个电子系统的集体振荡，并以密度起伏的波的形式来表现。

我们把当金属表面存在的自由振动的电子与入射光的光子相互作用时，产生的沿着金属表面传播的电子疏密波称为表面等离子体波。

表面等离子体波存在于两种界面附近，在金属和介质界面产生的表面等离子体波示意图如图1-2所示。

图1-2 表面等离子体波1.3.3 表面等离子体共振传感器表面等离子体共振是一种由光入射金属表面引起的物理光电现象。

光在两相界面处发生全内反射时的消逝波，可以引发金属表面的自由电子产生表面等离子体。

当消失波和表面等离子体波发生共振时，全内反射将被破坏，使反射光强度出现最小值。

由此原理所构建的传感器基本结构如图1-3所示。

图1-3 消失波和表面等离子体波发生共振该传感器包括一个镀有薄金属镀层的的玻璃棱镜，其中金属层成为棱镜和绝缘体之间的界面。

利用P偏振光在一定的角度范围内照射棱镜，在棱镜与金属薄膜（一般是金或银）界面处将会发生全内反射。

将一层薄膜（如生物膜）沉淀在金属层上，绝缘物质的折射率会发生改变。

折射率依赖于绝缘物质和沉淀膜的厚度和密度的大小。

折射率发生变化将会引起响应信号的变化。

这就是SPR传感器对物质结合检测的基本原理。

SPR的实验方法一般为首先在传感片表面固定一个反应物，使其形成分子传感膜，然后，含待测物的样品以恒定的流速通过传感片，传感片上分子间相互作用的情况可由SPR信号的改变反映出来。

SPR传感器检测原理如图1-4所示。

图1-4 SPR传感器检测原理应用于SPR传感器的传感芯片有两个基本特征:首先是传感芯片玻璃表面覆盖有薄薄的金层，这是产生SPR信号所必需的条件，是探测生物分子之间相互作用的基础;另外一个特征是，在金层的上面又有一种覆层，这种覆层能够连接配体并为所要研究的分子相互作用提供适宜的环境。

为方便起见通常我们把连接在传感芯片上的分子称为配位体，把待测的分子称为分析物。

传感芯片表面的金层和其上的覆层是很稳定的，它能够耐受极端pH和许多中等浓度的有机试剂。

一旦配体被固定在传感芯片上之后，传感芯片对于各种试剂和条件的耐受程度就主要取决于所连配体的性质。

1.4 SPR传感器的技术特点[5]基于SPR技术研制而成的SPR传感器，主要用于生物化学领域的研究，特别是对生物分子相互作用动态实时过程的研究。

在检测过程中，先将其中一个反应物（配体）固定于传感芯片表面，含分析物的样品溶液以恒定的速率通过传感芯片，在传感芯片上的生物分子间相互作用导致SPR信号的改变，再通过计算机系统对SPR信号进行实时处理并将整个反应过程显示出来。

与传统的生化分析方法相比，SPR传感器具有以下技术特点：（1）待测物不需纯化。

由于生物分子的相互作用具有很强的反应特异性（或称专一性），当待测溶液流经传感芯片表面时，只有能与传感芯片表面的配体分子相互配对的分子才被选择性的结合，其它的分子则不被结合而随着流动相离开传感区域。

利用SPR传感技术分析生物样品，可直接将待测溶液注入流通池（或称反应池），而不需要对待测溶液进行预处理和纯化。

许多生物样品如血清、组织培养液、细胞或细胞抽提液等均不需要预先作任何纯化处理。

（2）样品无需标记。

在现有的各种生物组织分析方法中，大多数分析方法需要对样品进行标记。

如酶联免疫吸附试验、放射免疫法、免疫荧光技术。

这些分析方法基本都是通过标记物质产生的信号系统变化来确定物质的种类和数量。

标记一般需要引入放射性兀素或荧光物质，可能对生物分子活性有相当的影响，而且标记手段通常比较复杂。

SPR方法则不需要对样品进行标记，可直接检测样品生化指标的变化。

因为当待测溶液流经传感层时，只要样品分子与配体分子发生了相互作用，就可以引起传感层的折射率变化，导致SPR光谱发生变化，通过对SPR光谱进行分析就可以获得样品分子与配体相互作用的情况，进一步分析还可获取分子结合的强度和速度、解离的快慢、结合的位点以及样品的浓度及质量等重要信息。