原花青素的功能14047117谢刘伟、摘要：近年来研究发现,肿瘤细胞能够对结构与药理机制完全不同的化疗药物产生广泛的耐药作用,从而在临床上由于肿瘤细胞逐渐丧失对化疗药物的敏感性,因此导致临床治疗失败。
肿瘤细胞对化疗药物敏感性降低而产生抵抗的作用被称为肿瘤的多药耐药作用(Multi-drug resistance, MDR)。
多药耐药作用主要由·肿瘤细胞对细胞膜上ATP结合盒(ATP binding cassette, ABC)转运体超家族的过表达引起,使得这些转运体底物药物由细胞内泵出至细胞外。
其中,最为重要的是由MDR1基因编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp),其能够转运诸如蒽环类、长春碱类、紫杉烷类以及表鬼臼毒素类等多数抗肿瘤药物,从而,在多种人类肿瘤中引起了先天性与获得性的多药耐药作用。
目前,P-gp介导的肿瘤多药耐药作用被证实可以通过屏蔽其药物外排泵功能以及抑制其蛋白表达来有效的抑制。
因此,下调P-gp的功能与表达可以对P-gp相关的肿瘤多药耐药作用产生逆转,进而增加肿瘤对化疗药物的疗效。
伴随发现了维拉帕米能够有效抑制P-gp作用,掀起了一场对于P-gp 抑制剂研究与开发的潮流,采用化学方法合成了一系列能够抑制P-gp的化合物。
然而,其多数需要在较高的浓度起效,同时伴随产生了严重的药物副反应并引起产生了化合物固有的细胞毒性,因此,与这些合成P-gp抑制相关的临床实验结果均不能令人满意。
尽管一代又一代的P-gp抑制剂层出不穷,临床上仍然需要新的药物来克服由P-gp高表达产生的肿瘤药多药耐药作用。
所以,越来越多的研究者将目光转移至有效但毒性小的天然小分子化合物,希望这些天然化合物可以作为一种抗肿瘤治疗补充剂参与到抗肿瘤增敏作用中。
P-gp/MDR1在多种肿瘤细胞中被广泛研究,其中包括人卵巢癌细胞A2780以及其紫杉醇耐药细胞亚系A2780/T细胞。
从分子机制上来说,影响P-gp表达的相关信号通路包括NF-κB、MAPK、PI3、COX-2以及ROS通路等。
在这些涉及P-gp表达的通路中,NF-κB与MAPK通路又与肿瘤细胞的增殖、凋亡与转化密切相关。
外界刺激因素通过激活IκB的磷酸化从而引起IκB的泛素化,导致IκB的降解,因此在胞浆中释放出NF-κB,胞浆中游离的NF-κB又通过复杂的调节方式进入到细胞核内,参与调节其下游相关基因与蛋白启动子的活性。
在P-gp/MDR1启动子-159区域包含了NF-κB的结合位点。
因此,NF-κB激活的降低,使得进入到细胞核内结合到MDR1启动子中的NFκkB减少从而降低P-gp的过表达,这是P-gp下调的一条重要的通路机制。
此外,在P-gp/MDR1启动子-168区域包含了YB-1的结合位点,而MAPK/ERK(?)能够通过其磷酸化作用的激活从而激活YB-1的核转位,既而调节P-gp的表达。
说明MAPK/ERK的磷酸化,同样促使P-gp表达上调。
并且,MAPK通路中另外两条主要亚通路——JNK以及p38通路同样可以通过其磷酸化作用的激活来调节P-gp 的表达。
迄今为止,关于天然黄酮类多酚化合物是否可以通过调节NF-κB通路的激活与MAPK/ERK介导的YB-1来逆转多药耐药作用仍未见相关的研究报道。
此外,有报道表明,microRNA中niR-27a与miR-451能够调节P-gp的表达,而关于天然化合物是否能够通过调节microRNA的表达从而抑制P-gp的表达尚无报道。
原花青素(Grape seed procyanidin,GSP)是一类在自然界中广泛存在于水果、蔬菜、果仁、种子、花及树皮中,具有强大的抗菌、抗炎、抗过敏与抗氧化作用的黄酮类多酚化合物。
以原花青素作为主要有效成分的保健品碧萝芷广泛用于以食物补充剂的形式进行抗炎与治疗创伤的辅助治疗。
近年来,有研究报道原花青素能够抑制P-gp 在血脑屏障中的功能,但原花青素是否能够通过抑制P-gp从而逆转肿瘤多药耐药作用及其逆转机制尚未见相关研究。
因此,本课题通过研究原花青素是否能够增加紫杉醇与阿霉素在多药耐药细胞中的细胞毒性并且抑制P-gp/MDR1的表达与转录水平从而逆转肿瘤多药耐药作用；进一步探讨原花青素抑制P-gp表达与其参与调节P-gp表达相关的microRNA、抑制NF-κB激活以及MAPK/ERK通路介导的YB-1活性的相关性,从而揭示原花青素可能作为一种抗肿瘤增敏剂产生逆转多药耐药作用的机制。
内容和结果通过RT-PCR与Western blot法验证A2780与A2780/T细胞在P-gp/MDR1表达上的差异性,结果表明A2780/T在P-gp/MDR1mRNA与蛋白水平显著高表达。
此外,采用MTT法评价A2780/T与A2780细胞对紫杉醇与阿霉素的半数抑制浓度结果显示,紫杉醇(100.36±1.68μmol/L vs.0.23±0.02μmol/L)与阿霉素(15.08±0.39pμmol/L vs.0.65±0.02μmol/L)在A2780/T细胞中的IC50显著高于A2780细胞。
采用MTT法评价原花青素对紫杉醇与阿霉素在A2780与A2780/T 细胞中细胞毒性的影响。
以不同浓度的原花青素(0～40μmol/L)与不同浓度梯度的紫杉醇(A2780:0～20μmol/L; A2780/T:0～100μmol/L)及阿霉素(A2780:0～8μmol/L; A2780/T:0～80μmol/L)共同刺激A2780与A2780/T细胞48h。
实验中40μmol/L的维拉帕米作为阳性对照药物,MTT结果数据计算出细胞生存指数及紫杉醇或阿霉素的IC50,以均数±标准差(x±s)表示,统计学分析使用SPSS13.0软件进行,其中生存指数间比较采用析因设计的方差分析,IC50的比较采用随机设计的方差分析,方差齐情况下的组间比较采用LSD或S N K检验,方差不齐情况下的组间比较采用Dunnett检验。
结果表明,10～40μmol/L的原花青素能够显著降低紫杉醇(F=93.416,P<0.001)与阿霉素(F=74.057,P<0.001)对A2780/T细胞的生存指数,而对A2780细胞没有显著影响(F=0.412,P=0.799；F=2.219,P=0.078)。
此外,原花青素显著降低了紫杉醇(F=309.051,P<0.001)与阿霉素(F=118.655,P<0.001)在A2780/T细胞的IC50,而对A2780细胞IC50的影响没有统计学意义(F=0.490, P=0.744; F=0.0610, P=0.992)。
P-gp表达水平评价方面,以RT-PCR与Western blot技术分别对原花青素在A2780/T细胞中对P-gp/MDRl mRNA与蛋白水平表达的影响进行评价。
A2780/T细胞分别以0～40μmol/L的原花青素刺激48h或以40μmol/L的原花青素刺激0～48h, RT-PCR 结果以2-ΔΔct法分析,Western blot条带灰度值以归一化法处理数据,以均数±标准差(x±s)表示,采用随机设计方差分析进行数据分析,方差齐情况下的组间比较采用LSD或SNK检验,方差不齐情况下的组间比较采用Dunnett检验。
结果表明,原花青素能够显著抑制MDR1mRNA的表达水平,这种抑制作用具有浓度依赖性(F=7.621,P=0.006)与时间依赖性(F=11.222,P=0.001)；同时,原花青素能够显著抑制P-gp的蛋白表达水平,同样具有浓度依赖性(F=149.594,P<0.001)与时间依赖性(F=591.477,P<0.001)。
P-gp功能评价方面,分别采用R123累积实验与P-gp ATP酶活性检测。
原花青素(0～40μmol/L)刺激A2780与A2780/T细胞2h 后,加入10μmol/L的罗丹明123(Rhodamine123, R123)孵育2h,以多功能酶标仪检测细胞内R123的荧光强度；采用Pgp-GloTM Assay Systems试剂盒检测P-gp ATP酶的活性,通过原花青素(0～40μmol/L)或原钒酸钠与重组P-gp膜孵育后消耗加入的ATP,以ATP检测试剂产生的化学发光检测ATP的剩余量。
采用随机设计方差分析进行数据分析,方差齐情况下的组间比较采用LSD或S-N-K检验,方差不齐情况下的组间比较采用Dunnett检验。
结果表明,原花青素能够浓度依赖的增加R123在A2780/T细胞中的积累(F=64.228,P<0.001)而对R123在A2780细胞中的累积没有影响(F=0.958,P=0.471)。
此外,2.5～40μmol/L的原花青素能够浓度依赖的抑制P-gP ATP酶的活性,表现为增加了反应体系中ATP的剩余量。
建立Stem-loop PCR检测miR-27a与miR-451的方法,并以该方法评价不同浓度原花青素(0～40μmol/L)与原花青素(40μmol/L)刺激不同时间(0-48h)对A2780/T细胞中miR-27a与miR-451表达的影响。
通过随机设计方差分析比较结果显示,原花青素能够浓度与时间依赖的显著抑制miR-27a(F=54.553, P<O.001；F=107.670,P<0.001)与miR-451(F=75.339,P<0.001；F=92.757, P<0.001)在A2780/T细胞中的表达。
采用Western blot法与免疫荧光技术评价原花青素对P-gp表达的抑制与NF-κB的相关性。
原花青素(0-40μmol/L)刺激A2780/T细胞24h或40μmol/L的原花青刺激细胞0-12h后,随机设计方差分析结果表明,伴随着P-gp表达的显著下调(F=41.230,P<0.001:F=32.212,P<0.001),原花青素分别浓度依赖与时间依赖的显著抑制了AKT(F=598.126,P<0.001:F=149.594,P<0.001)与IκBα(F=599.284,P<0.001:F=373.460,P<0.001)的磷酸化水平,并上调了IκB蛋白的表达水平(F=717.144,P<0.001:F=291.728,P<0.001).进一步,评价原花青素对脂多糖(LPS)诱导的NF-κB激活是否存在抑制作用。
结果表明,1μg/ml的LPS 在上调P-gp的基础上显著上调了AKT、IκBα的磷酸化水平并下调了IκBα的表达水平。