微生物实验个人报告班级：09环工2班姓名：刘人豪学号：200930230215 组别：第五组一．实验目的：1.培养基的配制和灭菌（1）熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作（2）了解配制微生物培养基的基本原理，掌握配制、分装培养基的方法（3）学会各类物品的包装、配制（稀释水等）和灭菌技术2．细菌当然纯种分离、培养和接种技术（1）从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分离、培养细菌，掌握一些常用的分离和纯化微生物的方法（2）掌握细菌纯种分离的方法（平板划线法、浇注平板法）（3）学会几种接种技术（斜面接种技术、穿刺接种、稀释平板涂布法等）3.纯培养菌种的菌体、菌落形态的观察（1）观察通过实验分离出来的几种细菌相应的菌落形态特征二．实验仪器和材料：1.培养基的配制和灭菌：高压蒸汽灭菌器、干燥箱、煤气灯、培养皿（10套）、试管（20支）、移液枪和1mL枪头、锥形瓶（2个）、烧杯（一大一小）、量筒（200mL一个、10mL 一个）、药物天平、玻璃棒、玻璃珠（30个）、石棉网、药匙、铁架、表面皿、PH试纸和棉花等；牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH和琼脂等2.上述实验所准备的无菌物品（包括各种玻璃器皿、培养基、稀释水等）；活性污泥、土壤或湖水一瓶；接种环、酒精灯或煤气灯、恒温培养箱等三．实验原理：1. 培养基的配制原理：培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖的需要，由碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钙、镁、铁及微量元素和水，按一定的体积分数配制而成。

调节合适的PH值，经高温灭菌后以备培养微生物之用。

本实验配制固体培养基2. 灭菌的原理：灭菌是用物理、化学等因素杀死全部微生物的营养细胞和它们的芽孢（或孢子）的过程，灭菌法有干热灭菌、加压蒸汽灭菌、间歇灭菌、气体灭菌和过滤除菌等。

本实验使用加热灭菌，高温杀死细菌3. 细菌的纯种分离原理：细菌的纯种分离是从混杂的微生物群体中分散成能再培养基上长成单个菌落的分离方法。

有平板划线法、平板表面涂布法和浇注平板法等4. 细菌培养的原理：根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他细菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法、稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株5. 细菌接种的原理：接种就是将一定量的微生物在无菌操作条件下转移到另一无菌的并合适该细菌生长繁殖所需要的培养基中的过程。

接种技术有斜面接种技术、穿刺接种、稀释平板涂布法等6. 菌体、菌落形态的观察原理：由于微生物个体表面结构、分裂方式、运动能力、生理特征及产生色素的能力等各不相同，因而个体及它们的群体在固体培养基上生长状况各不一样。

按照微生物在固体培养基上形成的菌落特征，可以初步辨别是何种类型微生物。

个体形态通过涂片染色观察，进行革兰氏染色，并作镜检，确定其革兰氏染色反应四、实验过程：第一天：（周五下午）⑴洗涤玻璃器皿。

培养皿、试管、锥形瓶等用洗衣粉加去污粉洗刷冲净。

移液管先用洗液浸泡，再冲净，烘干待用。

⑵包装。

(移液枪一支,四支枪头)①培养皿的包装（10套）：由一底一盖组成一套，用牛皮纸将10套培养皿（皿底朝里，皿盖朝外，5套5套相对而放）包好。

②试管、锥形瓶的准备：取6支试管并加入9（mL/支）蒸馏水后盖上硅胶塞，待灭菌；取1个250mL锥形瓶并加入90 （mL/瓶）蒸馏水和15（颗/瓶）玻璃珠并用锡纸包好，放在铜丝篓中待灭菌（湿热灭菌）。

③培养皿采用干法灭菌：将包好的培养皿放到烘箱中，于160℃下烘2 h。

待温度降到100℃下后打开烘箱门冷却到60℃后拿出，待用。

⑶培养基的配制。

（实验配200mL培养基）（200mL量筒、试管10支、大小烧杯）①配制溶液：取250mL的烧杯盛入100mL蒸馏水，按培养基配方逐一称取各种成分(蛋白胨1g，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g)，依次加入水中溶解。

调节pH至7.2-7.4，加入琼脂粉2g，加热促进溶解，不断搅拌，全部溶解后，加水不足因加热蒸发的水量。

加热时搅拌。

（制作两份）（P.S.营养琼脂培养基：蛋白胨1g，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，琼脂2g，蒸馏水200mL，pH7.4。

）②调节pH：用质量浓度为100g/L NaOH 调pH至7.4。

③分装：1、分装锥形瓶：培养基分装量不超过锥形瓶总容量的3/5。

2、分装试管：将培养基趁热加至漏斗中。

分装时左手并排拿数根试管，右手控制弹簧夹，将培养基依次加入各试管。

用于制作斜面的培养基时，不超过试管高度的1/5。

慎防培养基沾在管口上。

每组取2支试管，倒入5mL培养基加硅胶塞后湿热灭菌（做斜面用）（如图所示）3、用锡纸将锥形瓶口封好，灭菌。

⑷稀释水的制备。

（锥形瓶1个、试管5支、玻璃珠30个）①锥形瓶稀释水的准备：取一个250mL的锥形瓶装90mL蒸馏水，放约30颗玻璃珠于锥形瓶内，塞上棉塞，包扎后灭菌。

②试管稀释水的制备：另取5支18mm×180mm的试管，分别装9mL蒸馏水，塞上棉塞，包扎后灭菌。

⑸灭菌。

湿热灭菌法：将需要湿热灭菌的包好的器皿、稀释水和培养基放到灭菌桶内的筛板上（或灭菌器的吊篮内）于121℃（0.103MPa）下灭菌15-20min。

⑹倒平板。

将灭菌好的冷却至50℃的培养基倒入培养皿中（约10-15mL/皿，每组10个皿），使凝固成平板。

将已融化并冷却到50°左右的培养基倒入培养皿（约10-15ML/皿），右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于37℃培养24～48h，然后观察结果。

a:皿法b:倒平板⑺斜面制作。

（5支试管斜面）灭菌后，冷却至50-60℃，将试管搁置成一定的斜度，斜面高度不超过试管总高度的1/2-1/3。

第二天：（周六上午）1. 取样称10 g土壤或河道底泥或湖泊底泥放到装有玻璃珠和90mL灭菌水的锥形瓶中，以150rmp的转速振荡20分钟，以分散细胞2. 稀释水样（试管5支、锥形瓶1个、移液枪一支）将1瓶90mL和5管9mL无菌水排列好，用记号笔依次编上10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。

在无菌操作条件下，用定量移液器（移液枪）从三角瓶中吸取1mL土壤悬液到装有9mL无菌水的试管中，吸吹3次，让菌液混合均匀，即为10－1浓度的菌液。

用1mL 无菌移液枪吸取1mL 10－1浓度的菌液于编号为10－2无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10－2浓度菌液。

同样方法，依次稀释到10－6。

如下图：10-410-510-62.平板的制作（表面皿10套、移液枪一支、酒精灯）（1）取10套无菌培养皿编号，10－4、10－5、10－6各3个，另一个为空气对照。

（2）取1支1mL无菌移液管从浓度小的菌液开始，以10－6、10－5、10－4为序分别吸取1mL菌液于相应编号的培养皿内(每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀)，再用无菌三角刮刀将菌液在平板上涂抹均匀。

每处理两个重复，留1套平板为空气对照（剩下3套平板待第二天纯化用，但需放置于超净工作台中并开启紫外灯灭菌）。

空白对照不用涂布。

（注意：由低浓度向高浓度移液，枪头不用更换，但涂布时每个浓度涂完后要将刮刀灼烧灭菌或更换刮刀）（4）取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上，倒置于37℃恒温培养24～48h，然后观察结果。

第三天：（周日上午）1.对培养皿中的所有菌落进行编号。

（可以用相机先拍下整个培养皿，然后在电脑中对菌落进行编号）2. 2. 文字描述，记录菌落的特征。

菌落形态图可用PS抠图绘制。

3. 3 .把培养出来的菌落和实验配给的样本进行对比观察，对于不同点和相同点都做详细记录。

4. 4.用接种环按照号码顺序选择集中细菌做涂片，进行革兰氏染色，并镜检，确定其革兰氏染色反应，并绘制形态图。

（由于不纯的单菌落，镜检会出现多种形态）。

5.5、、菌落计数：待观察完后，根据统计原则，获得土壤或河道底泥样品中细菌的CFU/mL数值。

（具体方法见附录）6. 细菌的纯化（平板划线法）选取一个分离较好的稀释度的细菌群落，用灼烧灭菌过的接种环从平板上挑取一环，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线。

划线完毕盖好皿盖，倒置于37℃的培养箱中培养24 h。

7. 平板清理：将不用的平板上的培养基。

第四天：（周一上午）将已经进行菌落纯化的平板在火焰周围转动一周，在无菌操作条件下，用接种环分别挑取平板上长出的单菌落，分别接种于各管斜面培养基上，塞好硅胶塞，放在试管架上置于30℃恒温培养箱中培养36h后观察。

斜面划线只需在斜面上由下而上划一直线。

斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜斜面培养基上的一种接种方法。

具体操作如下：①贴标签：接种前在试管上贴标签，注明菌名、接种日期、接种入姓名等。

贴在距试管口约2～3cm的位置。

也可用记号笔注明上述内容。

②点燃酒精灯。

③接种：用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。

接种操作必须按无菌操作法进行，技术要点如下。

手持试管：将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其它四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。

斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。

拔管塞：用右手指的无名指、小指和手掌边，先后取下菌种管和待接种试管的管塞，试管口缓缓过火灭菌，切勿烧得过烫。

见图所示试管口缓缓过火灭菌，切勿烧得过烫。

接种环冷却：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。

取菌：待接种环冷却后，轻轻沾取少量菌体或孢子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环的部分碰到管壁，取出后不可使种环通过火焰。

见图示。

接种：在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。

从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，切勿划破培养基。

也可用接种针仅在斜针，仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。

见图示。

塞管塞：取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。

塞棉塞时，不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。

将接种环灼烧灭菌，放下接种环，再将棉花塞旋紧。

观察：附录：菌落计数法1、进行平皿计数时，可用肉眼观察，也可用放大镜和菌落计数器计数。

记下同一浓度的3个平板（或2个）的菌落总数，计算平均值，在乘以稀释倍数即为1mL水样中的细菌菌落总数。

计数时应选取菌落数在30-300/皿之间的稀释倍数进行计数。