（二）反向遗传学技术 • 1.基因敲除技术（gene knock-o ut） • 基因敲除是获得携带有特定基因 突变个体的技术，基因敲除技术 是研究基因在发育中的功能的重 要方法。
2.条件基因敲除技术（conditional knock out）
• 通常采用的是Cre—lox系统。Cre编码一种重 组酶，可以识别并结合loxP位点并切除位于两 个loxP位点之间的序列。要进行条件基因敲除 技术需要构建两个小鼠品系，在其中一个品系 中在靶基因两侧都插入loxP位点，在另一个品 系中需要转入由组织特异性启动子控制的cre 基因。如果将这两个小鼠品系进行杂交，其后 代小鼠中，Cre会在特定组织中表达，在这些 组织中，靶基因就会被Cre切除而失活，从而 实现组织特异性的基因敲除（图绪. 16）。
（二）组织切片技术
• 观察到胚胎的内部结构，通常进行组织切片： • ①石蜡切片技术。
• ②冷冻切片是利用特殊的低温包埋剂对样品进 行包埋，在低温条件下进行切片的技术。 • ③振动切片机可以切新鲜的或经过固定的动、 植物标本，但切片较厚，不适于精细结构的观 察。
（三）分子生物学技术
• 聚合酶链式反应（polymerase chain re action，PCR），反转录PCR（RT-PCR）， Northern印迹杂交，Western印迹杂交， 免疫共沉淀技术常用于检测目的基因或 蛋白质在某一发育时期或特定组织中的 表达。抑制性差减杂交技术：其基本原 理是以抑制PCR为基础的DNA差减杂交。
• （一）灰色新月为细胞正常发育 所必需（空间极性问题）。 • （二）发育的循序渐进和细胞命 运的决定（时间极性）
第三节 发育生物学的发展简史（自 学）
后成论与先成论
细胞理论对胚胎发育和遗传概念的影响 发育的嵌合型和调整型 诱导的发现 遗传学和与胚胎学的结合 分子生物学与发育生物学的结合
第四节 发育生物学模式生物
1. 细胞分化（cell differentiatio n）。
• 细胞从一个受精卵经过分裂和分化，形 成结构形态和功能各不相同的各类型细 胞的过程叫细胞分化。 • 图式形成最初涉及多种细胞生物形体模 式（body plan）：主要包括胚轴形成(a xisation)、体节形成（segmentation）、 肢芽和器官原基（anlage）形成等事件。
二、发育遗传学技术 （一）正向遗传学技术
• 1.大规模诱变筛选 • 射线或化学诱变剂处理父本个体，在生 殖细胞产生随机突变，与野生型母本个 体杂交，子一代（F1）个体携带基因突 变。F1的每一个体再与野生型个体杂交， 产生每一子二代（F2）群体内杂交。如F 1个体携带基因突变，F2个体中就会有一 半个体是杂交突变体，在F3代中有1/4的 交配组合后代出现纯合突变个体而表现 出某种发育异常。
（二）发育生物学的疑难问题——发 育生物学研究任务：
• ①分化问题；②形态发生难题；③ 生长难题；④生殖难题；⑤进化难 题。 • 发育生物学的任务：概括讲，即在 生物个体层次和系统层次上揭示发 育机制问题。
二、与其它学科的关系
• 发育生物学是在胚胎学、细胞生 物学、遗传学、生物化学和分子 生物学等学科发展的基础上建立 起来的一门新兴的学科。特别是 胚胎学对其贡献最大。
发育生物学
Developmental Biology
南通大学生命科学学院 朱道立
绪 论
第一节 发育生物学的研究对象、任务及 其与其他学科的关系
发育生物学的的地位
一、发育生物学研究的对象、任务
• （一）对象 • 发育生物学（developmental biology）： 应用现代生物学的技术研究生物发育机 制的科学。生物个体发育（ontogeny）： 主要研究多细胞生物体从生殖细胞的发 生、受精、胚胎发育、生长到衰老和死 亡。也研究生物种群系统发生（systema tics development）。
• 1. 以多细胞生物个体发育为对象 主要研 究多细胞生物体从生殖细胞的发生、受 精、胚胎发育(妊娠、出生)、生长、衰老 和死亡,即使生物个体发育（ontogeny） 中生命过程发展的机制。 • 2. 研究多细胞生物的系统发生 研究生 物种群系统发生(systematics developm ent)的机制。
（七）细胞标记技术
• 在发育生物学实验中经常会用到细胞标记技术， 如对胚胎早期卵裂球分化命运图谱的研究，在 胚胎移植实验中标记供体或受体组织，在显微 注射实验中追踪被注射卵裂球的命运与表型等。 细胞内标记物常用的是荧光标记葡聚糖和辣根 过氧化酶，通过显微注射导入细胞内，经过荧 光显微镜或组织化学方法进行定位。
3.RNA干扰技术
• 抑制某一特定基因的表达是研究基因功能的重要方法。 • RNAi的作用机制如图绪.17所示。在RNAi过程中，长的 dsRNA首先被一种RNA酶III（Dicer）裂解为21～23个 核苷酸的小干扰dsRNA（small interfering RNA， si RNA），这些siRNA带有5’端磷酸基团和3’端的羟基， 3’末端带有2～3个突出的核苷酸。siRNA近而结合到 一种蛋白复合体中，形成RNA诱导的沉默复合体（RNA induced silencing complex，RISC）。双链siRNA解 旋，RISC利用其反义链识别同源mRNA并在配对区是中 间将目标mRNA水解，从而导致特异性的基因表达抑制。
二、动物发育的基本规律
• 动物共同的发育阶段：一般从受精开始， 到最后的组织器官形成，发育为幼体， 再通过生长发育成为成体。 • （一）配子发生（gametogenesis） • 配子发生是在睾丸生精细管和卵巢内进 行的。 • （二）受精(fertilization) • 精子与卵子结合形成双倍体合子的过程 叫受精。受精是胚胎发育起始。
幼虫（Larval）
变态( metamorphosis)
成体（Mature adult）
三、极性在发育过程中的作用
• 胚胎发育早期： • ①整体构架即躯体的体轴； • ②卵黄分布不均等使受精卵分为动物极和植物 极； • ③各种蛋白、mRNA等物质的浓度不相同等； • ④两侧对称的动物，胚胎发育首先要决定的是 身体的前后、背腹及左右三个体轴。
脊椎动物模式生物:
非洲爪蟾, 斑马鱼, 鸡, 小鼠 无脊椎动物模式生物: • 果蝇, 线虫
发育生物学研究技术
常用发育生物学研究技术
发育遗传学技术
正向遗传学技术
反向遗传学技术
一、常用发育生物学研究技术
• （一）显微镜技术 • 显微镜和解剖镜是必备工具， • 相差显微镜（phase contrast microscope）、 微分干涉差显微镜（differential interfere nce contrast microscope）：适用于观察活 的或未染色样品的精细结构。 • 激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning con focal microscope）利用荧光染料标记的特异 性抗体或探针，对胚胎或细胞中的特定蛋白或 mRNA的分布进行定性和定量研究。
• 4.吗啉代寡聚核苷酸（morpholi no oligonucleotides，MO） • MO是利用反义寡聚核苷酸抑制特 定mRNA的翻译而阻断目的基因功 能的方法。
5.显性抑制（dominant negative） • 显性抑制即通过过量表达显性抑 制型蛋白以阻断内源蛋白活性， 通过某种修饰或加工抑制野生型 蛋白功能的缺陷性蛋白。
2.插入诱变筛选（insertional mutagenes is screen）
• 利用转座子（transposon） 或病毒载体作为诱变剂。 • 在果蝇中常用P-因子转座子， 反转录病毒是一类RNA病毒。
3.突变基因的克隆
• 多数情况下采用定位克隆（positional cloning）的办法。 • 较常用的分子标记检测手段包括简单序 列长度多态性、限制片段长度多态性和 单核苷酸多态性分析。可以将突变基因 定位到几百千碱基的范围内。再获取该 染色体片段的基因组序列。过去通常要 采用染色体步行或染色体跳跃来进行。
• （六）神经胚形成（neurula） 在中胚层尚未 完全形成时，胚胎背中部的外胚层细胞增殖并 加厚，形成神经板，从两侧向上向内卷曲形成 神经褶。两侧神经褶在中间汇合形成神经管。 • （七）组织和器官原基的形成(anlage format ion of histogenesis and organogenesis) 组织和器官原基的形成牵涉到两个过程， 其一是图式形成；其二是细胞分化。
8. 果蝇中的克隆化分析（clonal analysis）
• 克隆化分析用于在胚胎特定组织中 诱导产生带有某一基因突变或过表 达的细胞群，以精确分析某些基因 或信号途径在发育过程中的功能。 这一方法常用于果蝇成虫盘研究。 克隆化分析是基于FLP重组系统的。
主要参考书
Gilbert S.F., Developmental Biology, 2000, 2003, 2006, 6-8th Edition, Sinauer associates, Inc. Sunderland, Massachusetts, U.S.A. Wolpert L, et al., 2002, Principles of Development, Second Edition， Oxford University Press， Twyman,R.M., 2001, Instant Notes in Developmental Biology, BIOS Scientific Publishers Limited. Twyman RM. , 2001, Instant Notes in Developmental biology. ©BIOS Scientific Publishers Limited Balinsky,B.L.,1975, An Introduction to Embryology, 4th Edition, Saunders Company, london. Twyman RM. , 2001, Instant Notes in Developmental biology. ©BIOS Scientific Publishers Limited