综合设计实验题目：微生物吸附底泥中重金属综合设计实验指导老师：包红旭专业：环境工程07级姓名：赵洋学号：271307102目录一、实验目的 (2)二、实验原理 (2)（一）微生物分离与纯化 (2)1、牛肉膏蛋白胨培养基的制备与灭菌 (2)2、平板划线分离法 (2)（二）铅离子测定分析原理 (2)三、实验仪器和试剂 (3)四、实验步骤 (3)（一）分离纯化制备试验菌种的菌悬液 (3)（二）不同条件下，微生物对铅离子的吸附效率的测定 (6)五、试验结果及分析 (8)1、微生物吸附剂添加量对吸附效果的影响 (8)2、微生物吸附剂在不同pH下的吸附效果对比 (9)3、菌龄对吸附效果的影响 (10)六、试验结论 (11)七、讨论 (12)微生物吸附底泥中重金属综合设计实验一、实验目的：1、学习并掌握培养基配制的原理，掌握配制牛肉膏蛋白胨培养基的方法和步骤。

2、学习并了解高压蒸汽灭菌的原理和操作技术。

3、掌握平板划线分离纯化微生物的原理以及操作方法。

4、了解生物吸附法处理重金属的机理机制。

5、掌握测定重金属含量的化学分析方法。

6、了解微生物对重金属吸附效率的影响因素。

二、实验原理：（一）微生物分离与纯化1、牛肉膏蛋白胨培养基的制备与灭菌牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。

其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。

在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。

琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。

琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。

由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。

2、平板划线分离法平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。

有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。

其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

（二）铅离子测定分析原理本试验采用二甲酚橙试剂比色法测定铅离子的浓度。

二甲酚橙的水溶液在很宽的pH值范围内呈黄色。

它与许多阳离子形成深红色或紫色的络合物。

各个络合物的稳定性也反映在这种物质在不同pH值下与阳离子显出可观察的颜色。

Pb2+能与EDTA 形成无色的1∶1 的稳定络合物,用0.2 %的二甲酚橙(呈亮黄色) 作指示剂,加入20 %的六亚甲基四胺或3 %的硝酸调节溶液的pH为5～6 ,此时Pb2+与二甲酚橙形成紫红色络合物,溶液呈现紫红色,然后用EDTA 标准溶液滴定至溶液由紫红色突变为亮黄色,即为滴定终点。

三、实验仪器和试剂1、仪器：分析天平（感量为0.0001g）；锥形瓶（容积500ml）；移液管（容积1 ml ，2 ml，5ml，10ml，20ml）；高温电炉；容量瓶（50、100、1000mL）；烧杯（50、100、150、1000mL）；无菌培养皿(直径90毫米)；pH试纸；胶头滴管；玻璃试管；接种环；酒精灯；高压蒸气锅；玻璃棒；恒温箱(培养箱)；摇床；721型分光光度计。

2、试剂：牛肉膏；蛋白胨；NaCl ；琼脂；无菌水；0.2 %二甲酚橙水溶液；1mol/L NaOH ，1mol/L HCl ；牛肉膏；蛋白胨；葡萄糖；氯化钠；Pb(NO3)2；0.001mol/L 的二甲酚橙溶液；pH=4的缓冲溶液；去离子水。

四、实验步骤：（一）分离纯化制备试验菌种的菌悬液1、培养基的配置配置牛肉膏蛋白胨的液体培养基，待培养基冷却后进行分装。

将分装完毕后的培养基进行高压蒸汽灭菌；灭菌完成后，从提供的菌种中挑取菌株进行接种，接种后放入恒温培养箱中进行菌株的恢复培养。

接下来，利用培养后的菌悬液作为挑选菌种，重复培养六个周期后，用所得到的菌种，配置固体培养基，采用平板划线法进行纯种分离。

纯种分离完成后，继续进行液体培养两个周期，即得到所需菌悬液，留作下一步的吸附实验材料。

①称量：按试验用微生物培养基配方，逐一称取各种药品放入烧杯中。

液体培养基配方：②溶解：将去离子水加入到上述烧杯中使各种成分溶解，难溶的物质，例如蛋白胨、加热促进其溶解，待全部溶解后，加水补足加热蒸发的水量。

制备固体培养基，加热融化琼脂时要不断的搅拌，避免琼脂糊底烧焦。

③调节pH值；初配好的培养基往往不能符合所需要的pH值，故需用pH试纸检测，并以一定浓度的盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节培养基溶液pH值至7—8。

④分装：将调节好pH值的培养基分装于十支试管和两个锥形瓶中(注意防止培养基沾污管口或瓶口，避免浸湿橡皮塞塞引起杂菌污染)。

分装液体培养基时，每支试管装的量为试管高度的1/3～1/2，锥形瓶中各加入250—300ml培养基。

分装完毕后，将试管及锥形瓶用橡皮塞塞紧，防止高压蒸汽灭菌时管内压力过大冲开。

在配制固体培养基时，需制作平板培养基，方法如下：⑤平板培养基的制作：在原有液体培养基的配方中加入20g琼脂,其余操作方法同液体培养基一致。

将溶解后的培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒入五个平板培养皿中，大约占培养皿高度的1/3左右。

然后放入无菌室平放、令其自然冷却凝固。

⑥包扎：加塞后，在全部试管胶塞外包裹双层报纸，并用棉绳捆扎好，同样的，将两个锥形瓶也用同样的方法包扎好。

最后，用记号笔注明培养基名称，日期。

平板培养基则五只均倒置后摞在一起，用报纸包裹住后用棉绳系紧。

2、灭菌本试验采用高压蒸气灭菌法。

①加水，立式锅是直接加水至锅内底部隔板以下1/3处。

②把需灭菌的器物放入锅内(器物不要装得太满，否则灭菌不彻底)，关严锅盖(对角式均匀拧紧螺旋)，打开排气阀。

③启动电源开关。

④待炉内水沸腾后，蒸气将炉内冷空气驱净，关闭排气阀。

⑤升压，升温。

关闭排气阀以后，锅内成为密闭系统，蒸气不断增加，压力计和温度计的指针上升，当压力达到1.05kg/cm2(温度为121℃)即灭菌开始，这时开、关电源，保证压力维持在1.05 kg/cm2，20min左右。

⑥中断热源，达到灭菌时间要求后停止加热，任其自然降压，当指针回到“0”时，打开排气阀(排气阀不能过早打开，否则培养基因压力突降，温度没下降而翻腾冲到棉塞处，既损失培养基又沾污了棉塞)。

⑦揭开锅盖，取出器物，备用。

3、微生物接种（1）液体培养基的接种第一次接种时是由斜面培养基接种到液体培养基中的方法。

用接种环挑取一环斜面培养基上的菌种送入液体培养基中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将环上的菌种全部洗入液体培养基中，取出接种环，塞上棉塞。

将锥形瓶轻轻摇动使菌体在液体培养基中均匀分布。

最后将接种环烧红。

在随后的恢复培养中，是由液体培养基接种到液体培养基中，此时采用移液管进行接种。

装培养基的十支试管灭菌完自然冷却后，以锥形瓶中培养完的菌悬液为菌株来源，向每支试管中加入0.5—1ml的菌悬液，向两个锥形瓶中分别加入2—5ml菌悬液。

（2）平板划线法分离微生物的过程：第一步观察并从完成恢复培养的菌悬液选择生长状态最好的菌悬液。

第二步用接种环挑取一环选择的菌悬液，在已做好的平板培养基上划线。

划线分离的操作如图表示。

4、菌种培养将接种完毕的试管和锥形瓶放在恒温箱中，于37℃（或28℃）条件下培养2~3天后取出观察，选择生长良好的菌悬液作为持续培养的菌种。

平板培养皿在培养时，要将划线平板倒置培养。

5、纯种分离、接种至液体培养基观察培养完成的划线平板培养皿上生长的菌落，记录菌落的大小、形态。

从中选择长势良好的单菌落作为纯种分离的菌株。

接种方法如下：①接种前将桌面擦净，将所需的物品整齐地放在桌上。

②将试管贴上标签，注明菌名、接种日期、按种人组别、姓名等。

③点燃煤气灯(或酒精灯)。

④将一支平板培养皿和一支待接的液体培养基放在左手上。

⑤右手先将橡皮塞拧松动，以便接种时拔出。

右手拿接种环，在火焰上将接种环由根部到接种玳烧红。

在酒精灯附近将培养皿打开一点缝隙，用烧红后的接种环在器壁上点一下使环冷却后，挑取选取的单菌落的细菌。

⑥在火焰旁，用右手小指，无名指和手掌夹住试管的橡皮塞将它拔出。

试管口在火焰上微烧一周，将管口上可能沾染的少量菌或带菌尘埃被烧掉。

将挑取了细菌后的接种环迅速伸入伸入装有灭菌后培养基的试管内，在培养基液体中来回搅动使细菌分散在培养基中。

抽出接种环，将试管塞上橡皮塞并插在试管架上，最后再次烧红接种玳则接种完成。

（二）不同条件下，微生物对铅离子的吸附效率的测定1、铅离子吸附试验方法本实验采用二甲酚橙试剂比色法测定铅离子的浓度。

2、基本原理二甲酚橙的水溶液在很宽的pH值范围内呈黄色。

它与许多阳离子形成深红色或紫色的络合物。

各个络合物的稳定性也反映在这种物质在不同pH值下与阳离子显出可观察的颜色。

3、试剂0.001mol/L的二甲酚橙溶液，pH=4的缓冲溶液4、分析方法取水样于50mL磨口塞容量瓶中，然后加10mL的pH=4缓冲溶液，摇匀，再加10mL的0.001mol/L的二甲酚橙溶液，并用去离子水稀释至刻度，摇匀，静置1min后，在721型分光度计上，用5cm比色皿，于波长590nm处，以试剂空白做参比，测定吸光度。

5、吸附试验①微生物吸附剂添加量对吸附效果的影响分别取6mL铅标准溶液(含铅100ug/mL)于6只20mL试管中，同时分别加入14mL去离子水，在6只试管中分别缓缓加入0、1、2、3、4、5ml微生物吸附剂，静置10min，于高速离心机上（4000rap/min）进行离心分离15min，取上清液5mL于50mL容量瓶中，加入去离子水补足50mL，以下操做见上述中的分析方法。

根据测得的吸光度从标准曲线上查出相对应的铅离子含量，再通过吸附前后溶液中铅离子浓度计算出微生物对铅离子的吸附率。

②微生物吸附剂在不同pH下的吸附效果对比分别取6mL铅标准溶液(含铅100ug/mL)分别装入4只试管，并用去离子水补足至20mL，分别在pH=6、7、8、9的情况下平行试验，缓缓加入2mL新老微生物吸附剂至4只试管，静置10min，取上层清液5mL于50mL容量瓶中，加入去离子水补足50mL，以下操做见上述中的分析方法。

根据测得的吸光度从标准曲线上查出相对应的铅离子含量，再通过吸附前后溶液中铅离子浓度计算出微生物对铅离子的吸附率。

③菌种培养时间对吸附效果的影响分别取6mL铅标准溶液(含铅100ug/mL)分别装入4只试管，并用去离子水补足至20mL，在pH=6的情况下分别加入培养48h和培养168h的微生物吸附剂，静置10min，取上层清液5mL于50mL容量瓶中，加入去离子水补足50mL，以下操做见上述中的分析方法。