温度对木瓜蛋白酶活性的影响实验目的1.1掌握蛋白酶活性的测定方法1.2 理解酶促反应的最佳温度、酶的热稳定性1.3 了解蛋白酶的催化反应机理2实验原理酶既具备一般非生物催化剂的加快反应速度的功能，又具有一般催化剂所不具备的生物大分子的特征。
酶与一般非生物催化剂相比，具有以下几个特点：a.酶的主要成分是蛋白质。
b.酶促反应所需的活化能较低。
c.酶的催化效率非常高。
d.酶具有高度的专一性。
影响酶作用的因素有酶的浓度、底物浓度、pH、温度、激活剂及抑制剂等。
木瓜蛋白酶属于中性蛋白酶，它的催化作用受温度的影响较大。
在最适温度下，酶的反应速度最高。
大多数动物酶的最适温度为37-40℃，植物酶的最适温度为50-60℃。
另外，酶的热稳定性也是酶性质研究的重要内容。
酶对温度的稳定性与其存在形式有关。
有些酶的干燥制剂，虽加热到100℃，其活性并无明显的改变，但在100℃的溶液中却很快地完全失去活性，但不能使酶失活。
木瓜蛋白酶是一种具有广泛底物专一性的巯基类蛋白酶。
有很强的分解蛋白质的能力，此外还具有水解酰胺键和酯键的特性。
由于它具有适用pH范围广，热稳定性好等优点，广泛应用于食品，工业，医药生产中。
位于木瓜蛋白酶活性中心的巯基（-SH）具有很强的亲核性，一般是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团，极易被氧化形成二硫键（-S-S-）而导致木瓜蛋白酶失活。
3 主要仪器与药品3.1试剂：钨酸钠、钼酸钠、磷酸、浓盐酸、硫酸锂、浓溴水、无水碳酸钠、三氯乙酸、NaOH、磷酸二氢钠、酪蛋白、酪氨酸、木瓜蛋白酶福林试剂的制备：于250mL磨口回流装置中加入钨酸钠10.0g、钼酸钠2.50g、蒸馏水70.0mL、85%磷酸5.0mL、浓盐酸10.0mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷凝管，在通风橱中加入硫酸锂5.0g、蒸馏水5.0mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴。
冷却后仍有绿色，再加入数滴溴水，煮沸，冷却，加水定容至100mL。
混匀，过滤。
制得的试剂呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
（使用液：1份福林试剂与2份水混合，摇匀。
）0.4mol/L Na2CO3溶液：称取无水碳酸钠42.4g，用水溶解并定容至1000mL。
0.4mol/L 三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。
0.5mol/L NaOH溶液：称取NaOH固体2.0g，用水溶解并定容至100mL。
1mol/L HCl溶液：量取浓盐酸（13mol/L）7.6mL，用水稀释至100mL。
缓冲溶液（pH=7.0）:称取磷酸二氢钠3.12g，加水溶解并定容至1000mL。
最后滴加浓NaOH调节pH为7.0。
10mg/mL 酪蛋白溶液：称取酪蛋白1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L NaOH溶液湿润后，加入pH=7.0的缓冲溶液80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液贮存于冰箱。
100μg/mL L-酪氨酸标准溶液：（1）称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L HCl 60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪蛋白标准溶液。
（2）吸取1mg/mL 酪蛋白标准溶液10.00mL，用0.1mol/L HCl溶液定容至100.0mL，即得到100μg/mL L-酪蛋白标准溶液。
1.0mg/mL 木瓜蛋白酶：准确称取木瓜蛋白酶50.0mg，用pH=7.0的缓冲溶液定容至50.00mL，于4℃下保存。
3.2仪器：250mL圆底烧瓶、回流冷凝管、电热套、棕色试剂瓶、50mL容量瓶、100mL 容量瓶、1000mL容量瓶、电子天平、分析天平、冰箱、试管、分光光度计、恒温水浴4 实验方法与步骤4.1酸标准曲线的绘制：取6支干燥的试管按照表1分别移取相应溶液，置于40℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，1.00cm比色皿，以不含酪氨酸的0号管为空白，分别测定其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线。
表1 酪氨酸标准曲线溶液的配制管号酪蛋白标准溶液的浓度c/(μg/mL)100μg/mL L-酪氨酸标准溶液的体积V/mL水的体积V/mLNa2CO3溶液的体积V/mL福林试剂的体积V/mL0 0 0.00 1.00 5.00 1.001 10 0.10 0.90 5.00 1.002 20 0.20 0.80 5.00 1.003 30 0.30 0.70 5.00 1.004 40 0.40 0.60 5.00 1.005 50 0.50 0.50 5.00 1.004.2 木瓜蛋白酶活性测定：4.2.1先将酪素溶液放入40℃恒温水浴中，预热5min。
4.2.2按下列程序操作：试管A（空白）↓加酶液1.00mL↓40℃ 2min加三氯乙酸2.00mL↓40℃ 10min加酪蛋白1.00mL↓离心（每分钟2500转）5min试管B（酶试样）↓加酶液1.00mL↓40℃ 2min加酪蛋白1.00mL↓40℃ 10min加三氯乙酸2.00mL↓离心（每分钟2500转）5min↓ 过滤 ↓取1.00mL 滤液↓加碳酸钠溶液5.0mL↓加福林试剂使用液1.00mL↓40℃ 显色20min于680nm 波长，用1cm 比色皿测其吸光度 ↓ 过滤 ↓取1.00mL 滤液↓加碳酸钠溶液5.0mL↓加福林试剂使用液1.00mL↓40℃ 显色20min于680nm 波长，用1cm 比色皿测其吸光度4.2.3 酶活力的定义：在上述条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg 酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位（U ）。
蛋白酶活力=)/(00.1104sin mg U C C emzymee tyro ⨯⨯⨯式中：C tyrosine —由样品测得A 680值，查标准曲线得相当的酪氨酸浓度（μg/mL ）； 4—4毫升反应液取出1mL 测定（即4倍）； 10—反应10min ；1.0×10-3—取酶试液1mL ；C emzyme —木瓜蛋白酶浓度（mg/L ）4.2 酶促反应动力学：按照表2分别配制不同浓度的酪蛋白溶液，然后测定40℃不同底物浓度下的木瓜蛋白酶的活力。
以1/V i 对1/[S]作图，可得Lineweaver-Burk 图，由直线的斜率和截距可求K m 和V max 值。
表2 不同浓度酪蛋白溶液配制管号 酪蛋白溶液的浓度c/(mg/mL)10mg/mL 酪蛋白溶液的体积V/mLpH=7.0的缓冲溶液的体积V/mL1 1 0.40 0.362 2 0.80 0.3234 0.16 0.24 4 6 0.24 0.165 8 0.32 0.80 6104.004.4 最适反应温度：改变反应体系的温度测定其酶活。
以40℃为起点，每升10℃作一个测试，直至酶活力明显下降为止。
以吸光度A 为纵坐标、温度T 为横坐标绘制曲线。
4.5 热稳定性的测定：将酶液分别在60℃、70℃、80℃温度下受热，每隔10min 分别取出少量酶液，于冰箱中冷却至4℃，然后测定它们的酶活。
为吸光度A 为纵坐标、时间t 为横坐标绘制曲线。
5 实验数据记录与处理5.1酪氨酸标准曲线的绘制图-1酪氨酸标准曲线5.2木瓜蛋白酶活性测定管号酪蛋白溶液的浓度c/(mg/mL) 吸光度A酪氨酸浓度c/(μg/mL)蛋白酶活力1 0.25 0.073 0.017 0.00682 0.5 0.217 0.267 0.10683 1.0 0.267 0.349 0.13964 1.5 0.296 0.402 0.16085 2.0 0.322 0.449 0.17966 2.5 0.338 0.476 0.1904图-2 40℃不同底物浓度下的木瓜蛋白酶的活力图-3 Lineweaver-Burk图1/Vmax=14.7mL.min.μg-1 km/Vmax=13710.8 minVmax=7.09×10-2 μg.mL-1.min-1\ Km =934.6μg.mL-15.3最适反应温度图-4木瓜蛋白酶催化最适反应温度5.4热稳定性的测定图-5 60℃木瓜蛋白酶热稳定性图-6 70℃木瓜蛋白酶热稳定性图-7 80℃木瓜蛋白酶热稳定性6．实验结果与讨论6.1 酪氨酸标准曲线的绘制酪氨酸标准曲线的绘制图如图-1所示，所得标准曲线方程y=0.56961x+0.06699, R 2=0.98934.相对偏差较小，较符合实验要求。
6.2 木瓜蛋白酶活性测定 根据图2所示，底物浓度较小时，木瓜蛋白酶的催化活力随底物酪蛋白的浓度的升高而升高；当底物酪蛋白的浓度升高至一定值时，木瓜蛋白酶的催化活力不再随底物浓度的升高而变化；此时，该实验条件下，木瓜蛋白酶的活性基本接近最大值。
6.3 酶促反应动力学根据图2可知，当底物的浓度很低时，反应速率的增加和底物浓度的增加呈线性关系；但随着底物浓度继续增加，反应速度的增加就比较慢；当底物浓度增加某种程度时，反应速度就不增加，趋向接近最大反应速率的现象。
显然，这是属于单底物酶促反应动力学的特点，明显区别于化学催化剂催化。
同时较符合Victor Henri 提出的，酶催化底物转化产物之前，底物与酶首先形成中间复合物，最后由中间复合物转变成产物并释放出酶的观点。
即E+S ES E+P 模型。
40℃时，测得不同底物浓度下的木瓜蛋白酶的活力。
以1/V i 对1/[S]作图，可得Lineweaver-Burk 图，由直线的斜率和截距可求得Vmax=7.09×10-2μg .mL -1 .min -1和 Km =934.6μg/mL 。
根据文献可知木瓜蛋白酶在60℃，Km 值分别为2.53mg·ml -1，而本实验中的Km =934.6μg/mL 明显小于文献值；其原因40℃并不是木瓜蛋白酶最适反应温度60℃左右，会很大程度影响Km ，此外还受pH.离子强度等影响也将导致与文献值存在较大偏差。
7．思考题7.1福林试剂于酪氨酸显色的原理是什么？福林试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于酪氨酸分子中有含酚基，可使酪氨酸与福林试剂呈上述反应，且蓝色的深浅与液中酪氨酸量成正比。
7.2根据酶活力的定义，如何推导出酶活力的计算公式？酶活力的定义：酶催化一定化学反应的能力。
在特定条件下，1分钟内转化1微克底物所需的酶量为一个活力单位(U)。
酶活力=)/(n mg U C V t C emzyme⨯⨯⨯底物式中：C 底物—由样品测得A 680值，查标准曲线得相当的底物浓度（μg/mL ）； n —n 毫升反应液取出1mL 测定（即n 倍）； t —反应时间 min ；V —取酶试液体积mL ；C emzyme —蛋白酶浓度（mg/L ）7.3lineweaver-buck 图中直线的斜率和截距分别是什么？ 截距为1/Vmax ；斜率为km/Vmax7.4最适温度下酶的稳定性最高吗？如何理解温度对酶的影响？不一定，酶的催化作用受温度的影响很大，一方面与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度。