木瓜蛋白酶实验记录2016.11.3实验前准备：所需试剂的配制：饱和硫酸铵：取150ml蒸馏水，放入冰桶中，不断加入硫酸铵固体，直至沉淀不能溶解，过滤取滤液，保存在4℃冰箱中。
酶保护剂：准确称量1.21g的半胱氨酸于100ml蒸馏水中，调节PH 至9.0，溶解半胱氨酸，再加入0.1871g的EDTA，定容至250ml，转入棕色瓶中。
预实验：确定实验的可行性酶液提取：①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。
②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。
③收集5ml乳汁加入95ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。
④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。
⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取10ml酶原液。
⑥分装木瓜蛋白酶原液，加入2ml酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.002mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。
对静置的酶液继续处理2016．11.4试剂配制考马斯亮蓝G-250染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G-250固体粉末，溶于50mL 95%乙醇中（95%乙醇取实验室无水乙醇47.5mL加2.5mL蒸馏水）再加入86% 磷酸100mL，倒入1000mL容量瓶加蒸馏水定容至1000mL。
静置1h后，取棕色试剂瓶用乙醇清洗干净用滤纸过滤溶液后封存。
重提木瓜蛋白酶实验设置对照一组开始即加入酶保护剂编号酶B*、一组加硫酸铵之前才加酶保编号酶*。
①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。
②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。
③收集10ml乳汁加入190ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。
④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。
⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取10ml酶原液（编号为酶液1）。
⑥分装木瓜蛋白酶原液，加入适量酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.002mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。
对静置处理后酶液继续处理2016.11． 5试剂配制标准蛋白质溶液（0.1mg/mL）:准确称取牛血清蛋白0.01g用蒸馏水溶解并稀释到100mL。
现配现用。
酪蛋白溶液：称取酪蛋白1.2g加入0.05mol/L磷酸氢二钠溶液160mL（取2.866g磷酸氢二钠固体加160mL蒸馏水即得溶液），置沸水浴中煮30min，时时搅拌，冷却至室温。
加1M盐酸调节PH至7.0 0.1 。
加蒸馏水稀释到200mL。
用前配置。
酶稀释液：A液称取半胱氨酸2.635g，氯化钠11.7g，加蒸馏水250mL 溶解；B液称取乙二胺四乙酸二钠1.115g，加蒸馏水100mL溶解；合并A、B液，搅拌均匀，用4.0mol/L氢氧化钠溶液调节PH值到5.5，加蒸馏水稀释至500mL 。
用前配置。
三氯乙酸溶液：取三氯乙酸3.6g，加乙酸钠5.98g和冰乙酸3.8mL，加水溶解并稀释至200mL。
酶活性的测量酪氨酸标准液和酶液处理酪氨酸标准液的制备：精密称取酪氨酸0.005g用0.1mol/L盐酸溶解并定容至100mL。
（此为50ug/ml的标准液）酶液的处理：取0.3ml酶液，加酶稀释液2.7ml，稀释至3mL。
操作待测液：准确量取酶液溶液各1.0mL，分别置于2支10mL 带塞试管中，于50度水浴预热5分钟，准确加入50度预热的酪蛋白溶液5mL，立即振摇，置50度水浴中，精确反应10min后，加三氯乙酸溶液5.0mL，振摇，于50度水浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在275nm的波长处测定吸光度A。
②空白对照液：再精确量取酶液1.0mL，置于10mL具塞试管中，于50度水浴预热5min，准确加入50度预热的蒸馏水5ml, 置50度水浴中，加入三氯乙酸溶液5mL，振摇，于50度水浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在275nm的波长处测定吸光度A0。
③酪氨酸标准液：另取酪氨酸对照溶液，以蒸馏水为空白，在275nm的波长处测定吸光度An。
分别测量酶液的酶活力由于吸光度大于1,对测定结果影响较大故结果不能使用2016.11.9重提木瓜蛋白酶①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。
②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。
③收集10ml乳汁加入100ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。
④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。
⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取3ml酶原液（编号为酶液1）。
⑥分装木瓜蛋白酶原液，加入2ml酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.002mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。
40%饱和硫酸铵提取45%饱和硫酸铵提取2016.11.10试剂配制500ml的2%(m/v)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液：称取10g 的碳酸氢钠和0.1871g的EDTA溶于500ml蒸馏水中，调节PH至8.0。
500ml的1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液：称取0.1871g的EDTA溶于500ml 蒸馏水中，调节PH至8.0。
对过夜的酶液继续处理40%饱和硫酸铵提取45%饱和硫酸铵提取8000-14000标号的透析袋处理：①取透析袋剪成适当长度的小段。
放入大体积的2%(m/v)碳酸氢钠和1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10分钟。
②用蒸馏水彻底漂洗透析袋。
放在1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。
③冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。
从此时起取用透析袋是必须戴手套，在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。
④系好透析袋的一端，从另一端注入酶液，将透析袋放入蒸馏水中，在摇床上震荡，时时换蒸馏水。
⑤直至向蒸馏水中加入氯化钡溶液，无沉淀产生及透析除盐完成。
取出蛋白质溶液。
2016.11.11酶活性的测量酪氨酸标准液和酶液处理酪氨酸标准液的制备：精密称取酪氨酸0.005g用0.1mol/L盐酸溶解并定容至100mL。
（此为50ug/ml的标准液）酶液的处理：取0.1ml酶液，加酶稀释液0.9ml，稀释至1mL。
操作酶活力单位（U）定义：在以上条件下,每分钟水解酪蛋白生成1μｇ酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位（U）。
公式：酶活力（U）=x W1x11x n÷10式中:Ｗ1—酪氨酸标准液的浓度(μｇ/ml);10—反应时间;11—测定总体积;n—待测液的稀释倍数;分别测量各样品酶液的酶活力，结果如下：加标准1、酶质量的测量：考马斯亮蓝G-250法测蛋白含量取8支15 mL试管，按下表加入试剂将试管摇匀，放置2-3分钟。
用分光光度计比色测定吸光值A595nm。
(注意应在1小时内完成比色)，以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测得的数据如下表用倍比稀释的方法找出酶液测吸光度的最适倍数，再从新取样测量，取1ml酶液于试管中，再加4ml考马斯亮蓝溶液，混匀，静置5min后在A595下测吸光度，再根据标准曲线算质量。
SDS-PAGE电泳试剂配制：30%丙烯酰胺(Acr)：称Acr29.0g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)1.0g，加蒸馏水至100mL，过滤后置棕色瓶中，4℃贮存可用1-2月。
10%十二烷基磺酸钠(SDS): 称取SDS固体10g加蒸馏水溶解定容至100mL。
1.5mol/L pH8.9 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50mL水，用1mol/L盐酸调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100mL。
分离胶缓冲液，含0.4%SDS。
1mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液（浓缩胶缓冲液）：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100mL。
1×SDS电极缓冲液（0.1%SDS-0.025mol/LTris- 0.192mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至2000mL。
10%过硫酸铵(AP):称取0.5gAP加蒸馏水溶解定容至5mL。
TEMED（四甲基乙二胺）。
固定液：取50%乙醇454mL，冰乙酸46mL混匀。
考马斯亮蓝R250（SDS-PAGE专用）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250mL，过滤后备用。
脱色液：冰乙酸75mL，乙醇50mL，加蒸馏水定容至1000ml。
（一）SDS-PAGE电泳具体实验步骤1.实验前准备对蛋白质溶液进行取样，部分溶液进行浓缩，使其蛋白质含量提高，条带更加明显配制所需试剂；清洗玻璃胶板、梳子，要使与胶接触的一面玻璃板没有残余的胶并用蒸馏水多次冲洗风干不能有颗粒杂质；查阅相关资料对所用胶的浓度进行分析，已知木瓜蛋白酶的分子量为21KD-23KD，故可以选择12%的分离胶，选择分子量在14.3KD-97.2KD的蛋白质Marker做定性分析，实验室有5×上样缓冲液。
2.制胶将玻璃板在灌胶支架上固定好，配制一定浓度的分离胶、浓缩胶，配方见下表。
制好分离胶后，在15min内将胶沿一侧注入胶板中，避免产生气泡，加至高度到玻璃板的2/3处，加好后加入一定量的蒸馏水防止与空气过多接触，待分离胶凝固后（约40min）用滤纸将上层水分吸干再加入配制好的浓缩胶，将浓缩胶加满距玻璃板边缘5mm 处立即插入梳子（1.0mm 10孔），放置约30min使胶充分聚合老化。
3.样品处理经预实验得每孔点样量在20µl所得条带较好。
取已经浓缩的酶液15µl于1.5EP管，加5µl上样缓冲液，至沸水中煮沸10min，冷却后可点样。
4.点样、电泳将凝胶板固定在电泳槽上，倒入电泳缓冲液，使缓冲液没过点样孔，将梳子平衡地拔出，开始点样。
之后开始电泳，盖上电泳槽的盖子，电极对应准确，开始用80V恒压电泳，当样品进入分离胶界面后改用120V继续电泳，至可见的蓝色染液条带已接近胶板底部约1-2cm 处停止电泳，总用时约1.5h。
5.染色和脱色关闭电源，将胶板取出放在盛有水的平盘中，用平口镊子将两块玻璃板撬开，在胶板凹槽处用镊子划破将胶剥离下来，放在染色液中染色30min左右，再放入脱色液中脱色(不断换脱色液)至可以清楚的看到条带为止。