生物技术制药（Biotechnological Pharmaceutics）是不断引进现代生物化学、分子生物学、细胞生物学、微生物学和制剂学及现代基因工程等多学科先进技术而形成与发展起来的实用制药技术。

基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段：①上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。

目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。

选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。

此阶段的工作主要在实验室内完成。

、②下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。

此阶段是将实验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。

基因工程药物制药的主要程序：⒈目的基因的克隆⒉构建DNA重组体⒊DNA重组体转入宿主菌⒋构建工程菌⒌工程菌发酵⒍表达产物的分离纯化⒎产品的检验等反转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA克隆表达。

反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：RT-PCR是将以RNA为模板的cDNA合成同PCR 结合在一起，该法是mRNA经反转录合成cDNA第一链，在以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始协助下，PCR扩增，特异性的合成目的cDNA链（目的基因）。

化学合成法：较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。

合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA 双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。

基因表达：是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。

因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。

表达载体必须具备的条件（1）载体能够独立的复制；（2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。

并且克隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达；（3）具有很强的Promoter，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别；（4）具有Repressor，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；（5）具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录无关的基因。

（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列，以便转录后能顺利翻译。

影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素：（1）外源基因的拷贝数（2）外源基因的表达效率（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢负荷（5）工程菌的培养条件真核基因在大肠杆菌中的表达方式：（1）以融合蛋白的形式表达药物基因融合蛋白氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。

优点：操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定；易高效表达；但只能做抗原。

一般不做人体注射用药。

（2）以非融合蛋白的形式表达药物基因-----天然完整蛋白：非融合蛋白是指在大肠杆菌中表达的蛋白以真核蛋白的mRNA的AUG为起始在其氨基端不含任何细菌多肽序列缺点：易被蛋白酶破坏；N 端有甲硫氨酸，易引起免疫反应。

（3）分泌型表达蛋白药物基因--------- 产物可跨膜分泌至胞周间隙外源基因融合到原核蛋白信号肽序列的下游优点：分泌表达，避免降解。

乙酸产生的原因及防治方法：①碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。

②适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用③分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。

④加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。

“严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点ppGpp 的结果。

ppGpp是一个重要的调控分子。

它通过影响RNA链的延伸过程减少转录。

它的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子rrnA等的转录减少。

也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶与PL启动子专一识别反应。

基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。

质粒不稳定可分为：①分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。

②结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。

为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用两阶段培养法：⑴先使菌体生长至一定密度⑵再诱导外源基因的表达基因工程菌的培养方式：1. 分批培养2. 补料分批培养3. 连续培养4. 透析培养5. 固定化培养对发酵影响较大的几个因素有：1. 培养基的影响2. 接种量的影响3. 温度的影响4. 溶氧量的影响5. 诱导时机的影响6. 诱导表达程序的影响7. pH的影响目的产物的分离纯化：目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。

蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。

离子交换层析（ ion exchange chromatography IEC）：离子交换层析的基本原理是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。

它具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。

亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。

凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。

DNA、热原质和病毒的纯化方法：⑴ DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。

如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。

亲和层析和疏水层析也有效。

⑵热原质的去除热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。

分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。

⑶病毒的去除层析或过滤可将病毒去除。

包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒包含体蛋白复性方法：1 稀释复性和透析复性2 含二硫键的蛋白的复性3封闭蛋白的疏水蔟促进复性4凝胶过滤层析复性5 小分子添加剂促进的复性6分子伴侣或折叠酶促进的复性7人工分子伴侣的复性贴壁细胞：生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。

两种形态：成纤维细胞型、上皮细胞型悬浮细胞：生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。

如淋巴细胞。

兼性贴壁细胞：生长不严格依赖支持物。

如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。

接触抑制或密度依赖现象：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖。

此时若能保持充足的营养，细胞仍可存活相当一段时间，但细胞密度不再增加，这种现象称为……生产用动物细胞的要求：原代细胞、二倍体细胞系、转化细胞系生产用动物细胞获得的类型：①原代细胞：是直接取自动物组织器官,经过粉碎消化而获得的细胞悬液（109/g）。

需要大量动物，费钱费劳力。

鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞。

②二倍体细胞系：原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。

③转化细胞系：通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。

转化过程可以是自发的，和人工的，从肿瘤组织中。

④融合细胞系：（1）仙台病毒融合法（2）聚乙二醇融合法（3）电融合法⑤重组工程细胞系基因工程手段真核细胞基因表达载体的构建使用的载体有两类：㈠病毒载体：牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒。

牛痘病毒：用构建多价疫苗。

腺病毒、逆转录病毒：用于基因治疗。

杆状病毒：用于外源基因表达。

动物细胞的培养基的种类和组成：分3类:⒈天然培养基：血清、羊水、腹水等,成分复杂、成分不稳定⒉合成培养基：DME、 MEM、 DMEM、 HAM F12、 RPMI1640、氨基酸、维生素、糖类、无机盐、其它成分。

⒊无血清培养基：①提高重复性②减少微生物污染③供应充足稳定④产品易纯化⑤避免血清因素对细胞的毒性⑥减少血清中蛋白对生物测定的干扰。

无血清培养基加入添加剂：⑴生长因子和激素⑵结合蛋白⑶贴附因子和伸展因子⑷有利细胞生长的因子和元素添加小牛血清的作用：⑴提供生长因子和激素⑵提供贴附因子和伸展因子⑶提供结合蛋白⑷提供必需脂肪酸和微量元素动物细胞大规模培养的方法：依细胞种类: 原代培养、传代培养。

依培养基: 液体培养、固体培养。

依培养器和方式: 静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养。

从生产实际分为: 悬浮培养：让细胞自由的悬浮于培养基内生长繁殖。

贴壁培养：让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。

贴壁-悬浮培养：⑴微载体培养⑵包埋和微囊培养⑶结团培养。

动物细胞培养的操作方式：⒈分批式操作，⒉半连续式操作⒊灌流式操作动物细胞制药的前景与展望：一、提高产量降低成本和改进质量方面的研究二、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本三、抑制细胞凋亡，延长培养周期四、采用糖基化工程，提高产品质量五、转基因动物的研究六、组织工程的研究单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。

人鼠嵌合抗体：抗原抗体结合功能—抗体可变区（V）同种性免疫源性—抗体稳定区（C）在基因水平上将鼠源单抗的H 和L链可变区基因分离出来，分别与人Ig的H 和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H 和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。

噬菌体抗体库技术的基本方法：⒈获取目的基因⒉抗体库技术的载体⒊淘筛⒋表达与鉴定。

植物组织和器官培养：是指在无菌和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照、温度）下，研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。

外植体：用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。

突变体：细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞。

植物细胞培养培养基及其组成：培养基实际上是植物离体器官、组织或细胞等的“无菌土壤”，其特点是营养成分的可调控性。