三、材料、仪器和试剂
1、材料 市售鲜虾肉 2、仪器 ① 层析柱（直径1.0-1.3 cm；管长30 cm) ② MC99-3自动液相色谱分离层析仪； ③ 核酸蛋白检测仪； ④ 自动部分收集器； ⑤ 分光光度计； ⑥ 低温高速离心机；
3、试剂 （1） 葡聚糖凝胶Sephadex G-100 （2） 精氨酸激酶提取液 （3） 凝胶层析柱平衡液 （4） 凝胶层析柱洗脱液 （5） 精氨酸激酶测定液
四、操作步骤
（一）酶液的制备
（二）凝胶层析
1. 凝胶溶胀 根据柱床体积称取一定量 Sephadex G-100 干胶，加入蒸馏水，沸水煮沸2个小时，使之充分溶胀。
2. 装柱 用充分溶胀的Sephadex G-100装柱，装柱前，先 在柱中加入一定量的层析柱平衡液，然后倒入凝胶，打开 柱底部的出口，使其自然沉降,保持柱顶部缓冲液1-2 cm 高。
六、仪器使用
组装蛋白质 纯化系统
整
2
体
蛋
白
质
纯
化
1
3
系
统
4 1：自动馏分收集器 2：梯度混合仪 3：恒流泵 4：核酸蛋白检测仪
各种层析柱
梯度混合仪
核酸蛋白检测仪
光吸收值显示
样品池
灵敏度选择
调光吸收0
调透过率100
部分收集器
当前收集管号显示
洗脱液出口 收集管
当设置键盘 收集时间显示
流速显示窗 流速调节旋钮
精氨酸激酶的提取、 分离、纯化及活力测定
凝胶过滤分离纯化蛋白质
• 实验目的 • 实验原理 • 实验材料、仪器和试剂 • 实验操作步骤 • 仪器使用 • 思考题
一、目的
学习和掌握蛋白质的提取、凝胶层析分离 纯化精氨酸激酶的原理和操作技术，并学习目的 蛋白质的确定方法。
二、原理
凝胶过滤(Gel Fitration Chromatography，GFC) 又称分子筛层析、分子排阻层析、凝胶色谱。基本原理是 混合物中各组分通过层析柱时按其分子大小不同而被分离 的技术。固定相（凝胶）是一种不带电荷的具有三维空间 的多空网状结构的物质，分子量大的蛋白质不能渗入凝胶 颗粒内部，流程短，先被洗脱下来，而分子量小的蛋白质 可可以进入凝胶网孔，流程长，后被洗脱下来，从而达到 分离的目的。
恒流泵电源
记录仪
层析柜
思考题
• 1. 影响蛋白质分离效果的因素有哪些? • 2. 获得理想纯化结果应注意哪些关键步骤？ • 3. 蛋白峰的高低和和宽窄与纯化结果有关系？ • 4. 如何确定目的蛋白？ • 5. 如何评价蛋白质纯度？ • 6. 为什么蛋白质纯化过程中每一步都要测定蛋白
质 含量和活性？
蛋白质含量及酶活力测定
蛋白质含量测定可采用紫外法或考马斯亮蓝法。 酶活力测定：取3 ml 测活反应液于比色杯中，加入30 l酶液， 立即混匀并测定575 nm处的吸光值，计时，当吸收值达到1.4时 停止测定，并记录所需时间，以每秒575 nm处每变化0.001为一 个酶活力单位，如反应开始时A575为2.0，反应60秒后，A575为 1.4，则酶活力为
3. 加样 打开柱顶，用吸管吸出多余的缓冲液至柱床上薄薄一 层，然后加入酶液，加样量一般不超过凝胶体积的5%。
4. 洗脱与收集 打开恒流泵，控制流速进行洗脱，洗脱液通过 核酸蛋白检测仪并通过自动收集器收集，每管收集2min。
5. 收集目的蛋白 通过测定每个蛋白峰的精氨酸激酶活性， 确定目的蛋白所在的峰，收集，可通过离子交换层析进一 步纯化，直至达到单一蛋白峰。
80
8
60
6
protein content enzymatic activity
40

0
20
40
60
tube number
酶活力测定体系
分别取储备液即57 mmol/L 精氨酸、46 mmol/L ATP、66 mmol/L MgSO4 和指示剂 (包含 0.15% g/ml百里酚蓝和 0.025% g/ml 甲酚红) 各2 ml 加水到20 ml，调至pH 8.0 （575 nm下的吸收值在2.1 左右）。
各种层析技术的主要原理
凝胶过滤层析
交联的葡聚糖凝胶
凝胶颗粒
凝胶颗粒内部的网状结构
表1 常用凝胶分离范围
凝胶类型及规格 葡聚糖凝胶 （ sephadex)
聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-Gel ) 琼脂糖凝胶
（Sepharose）
G-200 G-100 G-50
G-25 P-300 P-150 2B 4B 6B
分离范围 6×105 1.5×105 3×104
5×103 5×105 1.5×105 1.5×105 1.5×105 1.5×105
精氨酸激酶活力测定(连续测活法)
精氨酸激酶催化精氨酸与ATP合成磷酸精氨酸 时释放出质子 。L-arginine+Mg•ATP
N-phospho-L-argine+Mg•ADP+H+ 用酸碱指示剂 (0.15 g/ml百里酚蓝和 0.025 g/ml 甲酚红) 指示溶液中质子生成的量，可表示精氨酸激 酶的活性。反应液的pH稍大于8.0时，其575 nm 处的吸光值下降（2.2~1.4范围内）与溶液中H+浓 度的增加成线性关系。 精氨酸激酶的活力用 A575/sec 表示。