• 采样液中最好已加入抗生素，否则回实验室要先 加入抗生素处理；
样本的运输
1、病毒培养物按照A类感染性物质进行包装运输， 其他感染性物质按照B类感染性物质进行包装运输。
2、病例的临床标本采集后，县级疾病预防控制机 构和病例收治的医疗机构要密切配合，按照生物安 全的相关规定进行包装，在24小时内送到当地流感 监测网络实验室进行检测。
• 患儿俯卧抬头，采集者左手托住患儿的下颌部，右手持无菌拭 子，将干拭子与上颚平行插入鼻孔（不要向上）直接与鼻咽后 壁接触，深度与到耳导管基本一致，轻轻旋转5秒吸附分泌物， 慢慢移出拭子，将拭子头浸入采样液中，弃去尾部。
样本采集方法 (3)
拭子的要求：
• 标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯 纤维）
液和鼻洗液）；
◆下呼吸道标本（如气管吸取物、肺洗液、肺组织标本）； ◆
血清标本；
◆
如病人死亡，应当尽可能说服家属同意尸检，及时进行尸 体解剖，采集组织（如肺组织、气管、支气管组织）标本；
注：应当尽量采集病例发病早期的呼吸道标本（尤其是下呼 吸道标本）和发病7天内急性期血清以及间隔2-4周的恢复 期血清。 要求 呼吸道标本：发病早期采样，每份不少于3ml 血清标本每份分为2管，每管不少于0.5ml
医疗机构
呼吸道标 本
无条件开展检测 或甲型抗原检测阳性 24h内
疑似病例双份血清样本
核酸检测H7阳性，48h内
送当地CDC网络实验室，进一步送省CDC
当地CDC流感网络实验室
H7N9禽流感病毒检 测阳性的标本
24h内
医疗机构未进行过 检测的疑似病例标 本
24h内
•
•
结果判断
• 4 .所有的临床标本RNA 检测都必须为阳性，且CT 值在35.0 以内才足可以证明样品的质量是可接受的。如果临床标本 RNA 检测为阴性，则可能是以下原因： • 4.1 临床样本核酸提取不正确导致RNA 的丢失或临床标本 里存在大量的RT-PCR 反应抑制剂。 • 4.2 样品中人细胞成分太少，以至于不能检测到。 • 4.3 反应液配制错误或程序设置错误。
环境标本检测送检要求
对人感染H7N9禽流感确诊病例可能暴露的 禽类饲养或交易等场所，采集禽类粪便、 笼具涂拭标本和环境污水等标本2周内开展 甲型流感通用引物、H5、H7和H9亚型检测。 没有条件开展病毒分离的实验室在2周内将 阳性标本送国家流感中心。具体技术要求 可参考《职业暴露人群血清学和环境高致 病性禽流感监测方案（2011年版）》。
样本的分装与保存
• 样本的分装：
采集的呼吸道标本每份分为3 管，每管不少于1ml。血清标本每份分为 2 管，每管不少于0.5ml。并填写湖南省不明原因肺炎病例疑似 人禽流感病例标本送检单。
• 样本的保存：
所有呼吸道标本应保存在4℃ ，并尽快放置在‐70℃。如 果没有‐70℃度冰箱，标本应保存在4℃ ，但不超过24小 时。切勿置于-20 ℃长期保存 。 血清样本应置-20 ℃长期保存 。 注：标本运送期间应避免反复冻融。
Dliu et al., Lancet, 2013
Gao RB, et al, NEJM,2013
Morens DM et al, NEJM, 2013
Yi Guan et al, Nature , 2013
采样人员
• 负责人感染H7N9禽流感病毒检测样本采集 的操作人员必须经过生物安全培训合格， 并具备相应的操作技能。 • 样本采集过程中操作者要加强防护，应穿 戴防护服、眼罩、N95及以上水平的医用防 护口罩、帽子、双层医用乳胶手套、鞋套 等个体防护装备。
阳性标本送检要求
若当地流感监测网络实验室检测结果为H7亚型禽流感病毒核酸 阳性时，应当于48小时内将其中2管呼吸道相关原始标本送省级 疾控中心网络实验室。 省级疾控中心网络实验室在接到医疗机构和本省网络实验室送 检的H7和H5亚型阳性的呼吸道标本时，未能开展病毒分离的省 级疾控中心网络实验室将阳性病例的原始标本48小时内送国家 流感中心开展病毒分离。 各医疗机构采集的双份血清标本48小时内送当地流感监测网络 实验室，由当地网络实验室48小时内将血清标本分别送省级疾 控中心和国家流感中心开展相关抗体检测，进行病例诊断。 对于甲型通用引物阳性而不能区分型别或亚型的毒株和阳性标 本要求在48小时内送至国家流感中心。
鼻洗液 患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5 ml生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患 者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧 杯收集洗液。重复此过程洗两侧鼻孔 漱口液 用10 ml生理盐水漱喉。漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理 盐水在咽部转动。然后，用50ml的无菌螺口塑料管收集洗液。
检测策略
• 不明原因肺炎病例标本检测： 建议各流感监测网络实验室收到不明原因肺炎标 本后，要在12小时内进行标本处理和核酸检测， 同时进行甲型/乙型通用引物，甲型H1N1流感， 季节性H3N2流感，A（H5）、A (H7和N9)亚型流 感病毒的检测。如果H5或H7/N9亚型检测阳性， 在生物安全三级实验室进行流感病毒的分离鉴定， 无病毒分离条件的实验室，将标本在24小时内送 国家流感中心进行复核鉴定和病毒分离。
人感染H7N9禽流感 采样以及实验室检测技术
湖南省疾病预防控制中心
微生物检验科 黄一伟 2014.8.21
流感病毒
流行性感冒病毒（简称流感病毒）：
是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，在分类 学上，流感病毒属于正黏液病毒科
理化特性：
对热敏感,56℃30min可灭活；最适pH为7.0～8.0，＜3.0 和＞10.0感染力很快被破坏；对紫外线敏感；对乙醚、氯 仿、丙酮等有机溶剂均敏感。 禽流感病毒灭活应该是65°30min，或者煮沸100°2min。
病原学检测
• （1）甲型流感病毒抗原筛查。呼吸道标本甲 型流感病毒抗原快速检测阳性。但仅可作为初 筛实验。 • （2）核酸检测。对患者呼吸道标本采用real time PCR（或RT-PCR）检测H7N9禽流感病毒核 酸。 • （3）病毒分离。从患者呼吸道标本中分离 H7N9禽流感病毒。 • （4）动态检测双份血清H7N9禽流感病毒特异 性抗体水平呈4倍或以上升高。
标本采集对象
• 不明原因肺炎病例。同时具备以下4条的病例: 1. 发热(腋下体温≥38℃)； 2. 具有肺炎的影像学特征； 3. 发病早期白细胞总数降低或正常,或淋巴细 胞分类计数减少； 4. 不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所 致的肺炎。 • 人感染H7N9禽流感疑似病例
样本类型
◆上呼吸道标本（包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱
强化监测采集的ILI 和SARI病例标本
48h内 阴性
血清 标本
H5，H7
阴性
甲、乙型通用及H5，H7
甲通阳性
H7/H5阴性
检测结束 停止 季节性流 感检测 病毒分离
及
医疗 机构 检测 H7 阳性 标本
季节性流感检测
H5/H7阳性
省级CDC实验室
血清
具备条件开展病毒分离
阳性 2周内完成
未能开展病毒分离
样本采集方法 (4)
血清标本
用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟， 1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于2ml无菌螺口塑料管 中。
样本采集方法 (5)
鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：
用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取 呼吸道分泌物。先将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负 压，旋转收集器头部并缓慢退出；收集抽取的粘液，并用 采样液3ml涮洗收集器1次（可用小孩导尿管接在50ml注射 器上来代替收集）。
样品采集/接收
• 对于人禽流感，咽拭子比鼻拭子检出率高。病毒滴度：气 管吸取物>咽拭子>鼻拭子，粪便中可能可检出。 • 标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。将原 始标本分为三份，取一份进行检测，其余保存在－70 ℃或 －70 ℃以下，短时间保存在4℃ ，不要保存在－20 ℃ 。
• 在生物安全二级实验室从事相关实验室活动时，操作者应 穿戴眼罩、N95及以上水平的医学防护口罩、防护服、帽 子、双层乳胶手套、鞋套等个体防护装备；实验活动应当 有２名以上的工作人员共同进行。
实验操作注意事项－避免污染
• 应特别注意假阳性产生。推荐以下预防污染的 方法：
– (a)实验准备与核酸提取使用独立区域； – (b)实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器， 微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）； – (c)实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无 粉手套； – (d)不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况 下均更换手套； – (e)试剂和反应管的盖子应尽量关闭。
呼吸道灌洗液：
将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管（约30cm深 处），注入5ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓 慢退出；收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器1次（可 用小孩导尿管接在50ml注射器上来代替收集）。
禽流感环境标本采集
• 采集粪便时一定要采集新鲜的（一般较湿润）粪 便，太陈旧（干燥）的粪便对我们的检测意义不 大； • 在养殖户家中采集粪便标本时，由于多鸡鸭混养 难以分辨鸭粪和鸡粪，最好能找到鸭子刚排泄的 新鲜粪便；
样本采集方法 (1)
咽拭子：左手用压舌板压住患者舌头，右手用2根聚丙烯纤
维头的塑料杆拭子同时檫拭双侧咽扁桃体及咽后壁，应避免 接触舌头，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，弃去尾部，旋 紧管盖。
样本采集方法 (2)
• 鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻
腭处（通常5cm以上），停留片刻后缓慢转动退出；取另1根聚 丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔；将上 述2根拭子浸入同一含3ml采样液的管中，弃去尾部，旋紧管盖。
• 铝或塑料做柄，不推荐棉拭子和木柄