全血PCR 直接扩增技术在亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性分析中的应用刘冉1，尹立红1*，浦跃朴1，周国华2，王仪3，潘恩春3，杨文洲3摘要： ［目的］ 应用全血PCR 直接扩增技术检测淮安汉族人群亚甲基四氢叶酸还原酶基因MTHFR C 677T 多态性并分析其地理分布特征，评价该技术在大规模现场人群基因多态性筛检中的应用价值。
［方法］ 应用全血PCR 直接扩增技术分析205例淮安汉族健康个体MTHFR C677T 的基因型分布频率，并与传统的聚合酶链反应—限制性片段长度多态性（Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism ，PCR-RFLP ）技术检测结果进行比对。
并将检测结果与已报道的不同地区汉族人群资料进行比较。
［结果］ 全血PCR 直接扩增技术与传统PCR-RFLP 法测定MTHFR C677T 多态性的分布频率具有高度一致性（Kappa =0.946，95%CI ：0.906~0.985）。
结果表明淮安汉族人群MTHFR C677T 的基因型频率分别为CC 32.68%、CT 46.83%、TT 20.49%；C 和T 等位基因频率分别为56.10%和43.90%；结合其他9个地区的汉族人群MTHFR 677T 等位基因频率的趋势性χ2检验，发现MTHFR 677T 的分布随地理纬度的降低，T 等位基因频率也降低（P =0.001）。
［结论］ 全血PCR 直接扩增技术简便易行，适用于人群基因多态性的快速筛检。
在所研究的10个中国汉族人群中MTHFR C677T 多态性显示与不同地理纬度的地区分布有统计学相关性。
关键词：外周血；亚甲基四氢叶酸还原酶；单核苷酸多态；筛检技术MTHFR C677T Polymorphism Rapidly Detected with Direct Ampli fi cation Protocol in Peripheral Blood Samples LIU Ran 1，YIN Li-hong 12*，PU Yue-pu 1，ZHOU Guo-hua 2，WANG Yi 3，PAN En-chun 3，YANGWen-zhou 3（1.School of Public Health ，Southeast University ，Jiangsu Nanjing 210009，China ；2.Huadong Research Institute for Medicine and Biotechnics ，Jiangsu Nanjing 210002，China ；3.Huaian Center for Disease Control and Prevention ，Jiangsu Huaian 223001，China ）Abstract ：［Objective ］ To examine the frequency distribution of methylenetetrahydrofolate reductase （MTHFR ）C677T polymorphisms in Huaian Han population and to evaluate the application of Direct Amplification Protocol for detecting genetic polymorphisms in population. ［Methods ］ Polymorphisms of MTHFR C677T in 205 Huaian Han healthy volunteers was detected with Direct Amplification Protocol and RFLP technique ，respectively. The frequency of MTHFR C677T gene types was compared with other Han population data from different areas in China. ［Results ］ There was high consistency of MTHFR C677T polymorphisms between the method with blood sample and with genomic DNA （Kappa =0.946，95%CI 0.906~0.985）. The frequencies of the C/C ，C/T and T/T genotypes in the subjects were 32.68%、46.83% and 20.49% respectively ，and the allele frequencies of 677C and 677T were 56.10% and 43.90% respectively. The analysis of MTHFR 677T allele frequency with Han population in other nine different areas in China showed the distribution of MTHFR 677T was decreased with geographical latitude （P =0.001）. ［Conclusion ］ The frequency of the genetic polymorphisms of MTHFR C677T in Chinese Han populations from different areas depends on geographical latitude. The MTHFR C677T distribution of Huaian Han population group is consistent with the model of population groups with the latitude range between N30° and N35°. Direct Amplification Protocol in peripheral blood samples is a good system of direct PCR amplification with blood sample for rapid identification of genetic polymorphisms.Key Words ：peripheral blood ；methylenetetrahydrofolate reductase ；single nucleotide polymorphism ；screening基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号：30571540，30671732）作者简介：刘冉（1974-），女，博士生，研究方向：肿瘤环境基因组学*通讯作者（Correspondent author）：尹立红教授，E -mail：lhyin@. cn 作者单位：1.东南大学 公共卫生学院，江苏 南京 210009；2.华东医学生物技术研究所，江苏 南京 210002；3.江苏省淮安市疾病预防控制中心，江苏 淮安 223001文章编号:1006-3617(2007)01-0021-04 中图分类号:R735.1；R394-33 文献标识码:A【论著】亚甲基四氢叶酸还原酶（ methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是叶酸代谢中的关键酶之一，它可将还原型辅酶I（NADPH）相关的5，10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸［1］。
前者生物学作用为细胞内一碳基团的传递体，参与嘌呤和嘧啶的合成及DNA 修复过程；后者作为甲基供体，在甲硫氨酸合成酶的催化下，同型半胱氨酸接收甲基基团，生成蛋氨酸，并进一步复甲基化为S -腺苷甲硫氨酸，参与体内广泛的甲基化反应。
这一代谢途径的正常运转在维持DNA 正常甲基化和核苷酸从头合成以及DNA 损伤修复是至关重要的［2］。
目前研究发现MTHFR基因在人群中具有多态性，C677T是最常见的突变，导致高度保守的丙氨酸突变为缬氨酸，降低黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）与MTHFR结合能力，影响MTHFR的酶活性和热稳定性［3］，可能与神经管缺陷、心脑血管疾病和部分癌症发生的遗传易感性有关。
目前单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism，SNP）的检测多采用外周血样本提取的基因组DNA，由于该方法不适于现场操作，且受到样本保存条件和DNA提取效果的限制，在大规模人群SNP筛检中不易推广。
本研究采用的全血PCR直接扩增技术，应用特殊的缓冲体系Cocktail PCR Buffer［4，5］，可用全血样本直接进行PCR反应，克服了传统PCR反应对DNA样本的要求高的不足，简化了操作过程，降低了研究成本和技术复杂性。
本研究对随机抽取的江苏淮安205例健康体检者采用全血PCR直接扩增技术检测MTHFR C677T的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP），并与以DNA为模板的传统PCR-RFLP方法进行比较，评价全血PCR直接扩增技术在大规模现场人群易感基因筛检中的应用价值。
同时，为进一步认识MTHFR第677位点多态性在中国汉族人群中的分布特征，我们结合已报道的9个不同地区汉族人群MTHFR C677T多态性资料，对MTHFR C677T多态与地理分布的关系进行分析，以了解影响叶酸代谢个体差异的因素，为进一步研究其与相关疾病的关系提供依据。
1 材料和方法1.1 研究对象随机抽取江苏淮安常住居民中健康体检汉族个体205名，男性127名，女性78名，年龄17~80（41.44±14.10）岁，调查研究对象的一般情况和吸烟、饮酒习惯，经调查对象知情同意后，同时抽取外周静脉血5 ml，EDTA抗凝，混匀后-20℃保存备用。
1.2 基因型分析1.2.1 MTHFR的全血PCR直接扩增留取外周全血样本1 ml直接用于包含MTHFR C677T多态位点的目的片段扩增。
引物序列：上游引物5′TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA 3′；下游引物5′AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG 3′；PCR反应体系：包括用于全血PCR反应的Cocktail PCR Buffer 3.93 μl，dNTP 200 μmol/L，引物1 μmol/L，Taq酶1.25 U，加水补充至24 μl，混匀，12 000g离心5 s后加入全血模板1μl。