金纳米颗粒聚集以及金纳米探针-微阵列技术研究进展逄键涛 文思远 王升启#（军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850）摘 要 金纳米颗粒（GNP ）探针正引起科学家们越来越多的兴趣。

本文主要综述了基于GNP 自组装聚集反应的生物检测和微阵列-金标银染检测的最新进展，对GNP 在电化学等其他领域的研究前沿也进行了探讨。

引用文献41篇。

关键词 金纳米颗粒，微阵列，生物检测，评述2005-08-10收稿；2005-12-03接受本文系国家863资助项目（No.2004BA519A46）1 引 言金纳米颗粒（GNP ）是直径为0.8～250nm ［1］的缔合胶体，具有纳米表面效应、量子效应、宏观量子隧道效应。

按粒子尺寸和聚集情况，GNP 可显示不同的颜色，已被广泛用于光学、电学、电子显微镜检测的生物分子标记［2］。

单个纳米颗粒的尺寸和颗粒间的组装形式，使胶体Au 溶液表现出不同的整体特征。

生物分子可参与到GNP 的聚集和组装过程中，从而干扰GNP 的原始组装方式。

通过胶体Au 溶液最终的物理状态（如颜色、吸光度等）可得到参与组装的生物分子的“质、量”特征，达到检测的目的。

另外，GNP 逐渐在生物芯片检测中显现出应用前景。

生物芯片技术本身是纳米尺度的分子操作和组装技术，芯片诊断、纳米检测等技术可以在此得到良好的融合。

本文着重就GNP 自组装以及GNP 探针-微阵列技术进展作一综述。

2 生物分子辅助的GNP 聚集和组装2.1 DNA-GNP 探针灵敏度高、特异性强、快速简单、低成本是生物检测的重要指标。

基于GNP 聚集反应的分子诊断方法能满足这些要求。

Mirkin 发现DNA 特异杂交可使DNA-Au 颗粒自组装为复合结构，开创了GNP 用于生物检测的新领域［3］。

GNP 经巯基修饰的短链DNA 修饰成为编码探针［4］，溶液中加入目标互补DNA 后，纳米颗粒发生有序、可逆的聚集反应［5］。

聚集后溶液颜色发生红7桃红7紫色变化，几小时出现桃灰色沉淀（DNA-胶体金沉淀）。

该现象是DNA 介导的胶体-胶体键合，其过程是可逆的。

系统在没有优化的情况下能检测10fmol 的寡核苷酸。

DNA 修饰的GNP 以非交联结构聚集，对于颗粒表面结合的杂交体末端错配有很好的选择性［6］，可对单核苷酸多态性（SNP ）进行检测。

5个人瘤细胞系的基因组DNA 的检测结果与传统方法（质谱、直接测序）一致。

这种方法不需要复杂的设备，为SNP 医护现场诊断、个性化医疗提供了可能。

Storhoff 等［7］研究了GNP 距离和光学性质的关系，开发出“杂交-读出”的比色检测方法，鉴别核酸序列。

DNA 修饰的金纳米探针识别核酸目标分子后发生颜色变化，可检测到zmol （10-21mol ）级的核酸，不需要目标分子的扩增或信号放大。

Sönnichsen 等［8］采用等离子体耦合对金银纳米颗粒间距进行测量，研究了金银纳米颗粒二聚体的实时组装以及单个DNA 分子杂交的动力学。

“等离子体标尺”可连续监控分子间距离上限达到70nm ，时间超过50min 。

2.2 非标记DNA 检测双链DNA （dsDNA ）比单链DNA （ssDNA ）表面负电荷堆积程度高，并且dsDNA 的双螺旋结构使氮（N ）、硫（S ）等对GNP 亲和性高的原子包埋更深，所以ssDNA 和dsDNA 对GNP 有不同吸附力。

Li 等［9，10］据此设计了基于Au 颗粒聚集反应的核酸杂交比色检测方法。

ssDNA 可吸附负电荷纳米金颗第34卷2006年6月 分析化学（FENXI HUAXUE ） 评述与进展Chinese Journal of Analytical Chemistry 第6期884～888粒，其结合速率与序列长度和温度有关。

GNP 吸附ssDNA 之后处于稳定状态，不会发生盐离子引起的聚集反应。

纳米颗粒对核酸的吸附为静电作用，不需要对Au 颗粒、探针或靶序列进行共价修饰。

目标分子和探针的结合是在溶液中进行的，其杂交时间少于1min ，整个检测只需5min ，不需借助仪器可检测到小于100fmol （10-15mol ）靶分子。

2.3 蛋白质检测标准凝胶免疫测定（SPIA ）是基于GNP 的生物特异性聚合和分光光度技术，用于蛋白质的检测。

Dykman ［11］报道了一种新型的SPIA 技术方法：采用微量滴定免疫板和酶联免疫吸附测定（ELISA ）阅读器。

以15nm Au 颗粒偶联的蛋白A ，检测IgG ，研究比较了新型SPIA 和普通SPIA 。

该方法的原理是生物分子-纳米金溶液的消光光谱在目标分子加入前后的变化，可能与Au 颗粒的聚合作用有关。

3 GNP 标记与微阵列检测随着高并行化、微型化检测需求的增长，荧光DNA 芯片在DNA 诊断学方面受到的关注越来越多。

荧光检测已被证明为有效可用并得到很好的开发，但它有一些问题难以解决，比如染料的低稳定性、物理化学环境影响到其发光强度、昂贵的检测设备等。

基于GNP 标记和银增强技术的微阵列检测技术，方法简单，成本低，信号灵敏、稳定，不受外部环境的影响，有利于微阵列技术在中小型医院的推广和医护现场检测［12］。

3.1 GNP 标记微阵列检测原理GNP 与生物活性分子的交联可得到大量新型的标记探针，如：Au-脂质、Au-Ni-NTA 以及Au-ATP 等［13］。

GNP 在固体表面的组装定位和金标银增强技术是纳米颗粒-微阵列检测的理论基础。

Csáki 等［14］采用扫描原子力显微镜研究了纳米金颗粒标记DNA 分子在芯片表面的分布和标记情况。

Peschel ［15］研究了GNP 的自组装过程及结构性质，尺寸及结构依赖物理性质。

DNA 具有独特的识别能力和物理化学稳定性，可作为GNP 的连接分子。

DNA 修饰的Au 胶体颗粒（1～40nm ）特异性固定在互补DNA 修饰的固体表面，构建出表面nm 结构。

Au-Ag 染色法是一种灵敏特异的可视化检测技术，源自现代照相技术、组织化学和免疫金技术，经过近10年来的优化组合，现已得到广泛应用［16］。

Ag 在Au 标记位点特异性沉淀，是一种光学或电子显微镜下的低放大率可视化方法。

Festag 等［17］对GNP-微阵列检测技术条件进行了优化，研究了不同的基底清洁、活化以及封闭方法，并优化了纳米颗粒标记及其他程序。

3.2 XNA （DNA 、RNA ）及SNP 检测Taton 等［18］最先开发出GNP 用于DNA 阵列分析的简单方法，包括寡核苷酸修饰GNP 探针和平板扫描仪。

GNP 标记的寡核苷酸目标分子在固体表面的熔解温度发生改变。

寡核苷酸互补序列与单核苷酸错配序列熔解温度的差异，可用于二者的鉴别，选择性是荧光标记方法的3倍。

Ag 增强信号放大方法可提高扫描色度阵列检测系统的灵敏度，超出荧光系统2个数量级。

Alexandre 等［19］提出了一种新型的比色检测方法，使微阵列技术可能成为用于科研和临床中的高效、低成本检测工具。

GNP 通过亲和素结合在生物素化的DNA 上，其结果信号产生于Ag +在GNP 表面的还原沉淀。

该比色方法与荧光检测方法相比较，检出限相当，大约为1amol （10-18mol ）生物素化的目标DNA 。

Wei 等［20］采用寡核苷酸和拉曼活性染料标记的GNP 探针实现了寡核苷酸的多重检测。

Ag 沉淀形成的Au-Ag 核壳结构可引发染料标记颗粒的表面增强拉曼散射。

方法在未优化条件下的检出限为20fmol ，具有高灵敏度和高特异性的特点。

采用拉曼标签作为窄带光谱指纹，据此可随意设计所需探针，增加了方法的多重和多比率检测能力。

Bao 等［21］提出了一个微阵列检测方法，可进行多重SNP 分型，不需目标扩增和去复杂性。

该方法依赖于GNP 探针的高灵敏度，不需要酶的参与。

特异性源于寡核苷酸和纳米探针的两步夹心杂交。

用非扩增人基因组DNA 样品检测3个血栓症基因的可能基因型，表明这种多重SNP 检测方法重现性良好。

该阵列检测方法简单、快速、稳健，适于多重SNP 的医护现场检测。

3.3 微生物诊断微阵列已逐步成为细菌检测和鉴定的新方法，具有高并行性检测的特征，但检测方法的复杂性和灵588第6期逄键涛等：金纳米颗粒聚集以及金纳米探针-微阵列技术研究进展敏度问题成为技术瓶颈。

Francoisa等［22］报道了一种新的检测技术，直接标记细菌总RNA，避免了酶放大的多步反应和可能的偏向性（如PCR）。

该研究比较了白光光源性能和2种激光荧光扫描仪检测的可靠性和灵敏度。

结果显示：纳米颗粒标记的细菌RNA能产生可重复性的共振光散射信号，强度至少是当前最新的共聚焦荧光信号的50倍。

Wang等［23］开发了一种基于纳米颗粒放大和夹心检测技术的乙肝病毒基因检测芯片，HBV特异性探针固定于玻片表面，与不同血清样本的PCR（聚合酶链式反应）产物杂交，杂交信号能容易地可视化观察。

庞代文等［24］采用纳米颗粒基因探针的可视化基因检测技术，采用“纳米放大”和银染色方法，对目标分子夹心杂交进行检测。

Ramakrishnan等［25］采用金纳米探针结合微阵列技术检测甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌。

以上方法避免了放射性、荧光或目标分子的扩增（PCR），具有简单、快速、灵敏度高、低成本的特点。

3.4 表达谱研究基于微阵列方法的基因表达分析在现代生物学中起了关键作用，但目前的微阵列基因表达谱大都需要反转录将mRNA转变为标记cDNA或cRNA。

在cRNA反转录过程中包括目标放大步骤，克服了普通荧光方法低灵敏度的缺点。

Huber等［26］报道了一种基于微阵列无酶扩增的基因表达分析系统，采用非扩增的人总RNA样品作为目标核酸。

杂交固定在微阵列表面的RNA分子通过其poly-A尾与oligo-dT20修饰的GNP探针杂交，信号由自动金相放大，然后由纳米颗粒介导的光散射检测。

纳米颗粒探针灵敏度高，可用少至0.5µg非扩增总RNA杂交进行基因差异表达分析，而不需费时、费力的样品标记。

miRNA的表达谱研究对于miRNA的生物功能研究有重要意义。

为避免使用高成本的检测仪器，Liang等［27］在实验中采用了纳米金颗粒探针及Ag增强方法，开发了一种新型的miRNA表达谱微阵列。

作者制作了检测11种来自水稻根、叶的miRNA的微阵列模型，有很好的实验重现性并与Northern blot 结果一致。

Storhoff等［28］用巯基修饰寡核苷酸的GNP探针，检测互补的目标DNA。

玻片表面固定有寡核苷酸捕获探针，用于捕获目标DNA，之后目标DNA通过GNP探针检测。

Ag放大后的信号通过简单的光学系统检测散失波诱导光散射。

与Cy3荧光标记相比，该方法的信号增强了1000倍。