福建水产,2007年3月第1期NO.1JOURNAL OF FUJI AN F IS HER IESM ar .26.2007水产品中孔雀石绿检测方法研究进展刘海新,张 农,钱卓真(福建省水产研究所,福建厦门361012)摘要:水产品的安全问题日益成为社会关注的焦点,近年来,我国出口的鳗鲡以及国内市场上的水产品都发现了孔雀石绿残留。

国内各有关检测机构相继开展了水产品中孔雀石绿残留量的检测。

本文对现有的各种检测方法的优点和局限性作一概述,以便研究者能在此基础上进一步改进和发展。

关键词:水产品;孔雀石绿;检测1 孔雀石绿的特性与危害孔雀石绿(M alachite green ,MG )属三苯甲烷类染料,化学名称为:四甲基代二氨基三苯甲烷,结构见图1。

在水产养殖中,孔雀石绿主要用来抗真菌感染和杀灭寄生虫,鱼类一般用于防治水霉病、烂鳃病以及寄生虫等。

其价格低廉,疗效显著,当前还找不到一种特效药完全取代孔雀石绿,因此曾经在水产养殖业中广泛应用[1]。

孔雀石绿进入水生动物体内后,会快速代谢成脂溶性的无色孔雀石绿(Leuco m a lach ite green ,L MG ),结构见图1。

据Berg w erff [2]等的研究,对欧鳗(Anguilla anguilla )采用孔雀石绿0 1mg L -1药浴处理24h 。

药浴开始6h 后,鳗鱼体内孔雀石绿残留到达峰值,药浴处理后72h ,体内90%孔雀石绿被代谢,720h 后有些鱼体中已检测不出孔雀石绿残留,1920h 后所有鱼体中都检测不出孔雀石绿残留。

而无色孔雀石绿在药浴处理后72h 达到峰值,然后缓慢代谢,720h 后只代谢了50%,2400h 后仍然可检测出鱼体肌肉中有15 12 g kg -1的无色孔雀石绿残留。

孔雀石绿具有潜在的致癌、致畸、致突变的作用,其在养殖业中的使用未得到美国食品与药物管理局(FDA )的认可[3];根据欧盟法案2002/675/EC 规定[4],动物源性食品中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留总量限制为2 g kg -1;日本的肯定列表也明确规定在进口水产品中不得检出孔雀石绿残留;我国在农业行业标准《NY5071-2002无公害食品鱼药使用准则》中也将孔雀石绿列为禁用药物。

2005年,福建、江西、安徽等省出口欧盟、日本、韩国的鳗鱼产品先后被检出孔雀石绿残留,我国水产品出口因此受严重影响;2006年,上海市场上的多宝鱼和香港市场上的桂花鱼,也福建水产总第112期都检出孔雀石绿残留。

水产品中孔雀石绿的残留问题日益成为社会关注的焦点。

2 检测方法现状孔雀石绿在水生动物体内会很快代谢成无色孔雀石绿,无色孔雀石绿的毒性甚至超过孔雀石绿。

因此,有关法规对动物源性食品中孔雀石绿残留限量的规定都是以孔雀石绿和无色孔雀石绿的总量为限量指标,要求相关的检测方法能检测出孔雀石绿和无色孔雀石绿总量。

目前,孔雀石绿的检测方法以理化检测法和免疫学检测法为主。

2 1 理化检测法2 1 1 薄层层析法[5-7](TLC)采用硅胶板分离孔雀石绿的薄层层析法,灵敏度低、定量误差范围大,要求被检样液中的目标化合物浓度较高。

该方法主要用于孔雀石绿药物的鉴定和具有高残留量基质中孔雀石绿的定性测定,不适于动物源性食品中孔雀石绿残留量的检测要求。

2 1 2 分光光度法[8]分光光度计灵敏度低,且没有对目标化合物进行分离定量的功能,在低浓度水平的复杂基质中,检测结果假阳性概率高。

目前,该方法仅局限于水样的检测,尚未见在复杂基质样品中应用。

2 13 高压液相色谱法(HPLC)孔雀石绿的沸点高,不易挥发,其色谱分析法多采用液相色谱法。

据H ajee[9]研究,采用正相的CN柱或反相的C8、C18柱都可以实现分离,反相柱的柱效和分离度较好。

目前,大多采用C18反相柱分离。

孔雀石绿在618nm处有吸收峰[10],可采用紫外可见检测器检测;无色孔雀石绿的吸收峰在267nm[11],同时也有荧光特性(激发265nm、发射360nm)[12],可采用紫外或荧光检测器检测。

基于孔雀石绿和无色孔雀石绿的光学特性,在检测手段上主要是通过以下四种方式实现对孔雀石绿和无色孔雀石绿同时检测。

2 13 1 可编程的紫外可见检测器[11]:根据出峰时间的不同,对孔雀石绿用618n m检测,对无色孔雀石绿用267nm检测,孔雀石绿和无色孔雀石绿的检测限都是2 g kg-1。

由于很多有机小分子在267nm处都有吸收,无色孔雀石绿目标峰附近干扰峰较多,该方法定性和定量的准确性不够理想。

2 13 2 紫外可见检测器前连接在线PbO2氧化柱[10,13]:通过PbO2将无色孔雀石绿氧化成孔雀石绿,618n m检测。

该方法定性和定量的准确性都比较理想,是我国现行的水产行业标准[10]和国家标准[13]采用的检测方式,对孔雀石绿检测限都是2 g kg-1;对无色孔雀石绿的检测限分别为4 g kg-1和2 g kg-1。

目前,国内各政府部门的检测机构和各水产品生产、加工单位普遍采用该检测方法。

由于使用了PbO2氧化柱,使得该方法也存在一些弊病,主要表现在:第一,由于在检测器前增加了氧化柱,加大了柱后体积,色谱峰扩展较大,降低了检测的灵敏度。

第二,氧化铅会将部分孔雀石绿转化成去甲基孔雀石绿[14],影响检测灵敏度。

第三,氧化柱的性能对色谱峰的对称性和响应值的大小会有一定的影响,目前这种PbO2氧化柱多为检测人员自己填装,性能不稳定。

2 13 3 紫外可见检测器检测和荧光检测器串联[12]:紫外可见检测器在618nm检测孔雀石绿,荧光检测器采用激发265nm、发射360n m检测无色孔雀石绿。

该方法充分利用紫外可见和荧光检测器的优点,克服了前两种检测方法中对无色孔雀石绿定性准确性不高和灵敏度低的缺点,将无色孔雀石绿的灵敏度提高到0 5 g kg-1,但对孔雀石绿的灵敏度仍然只有2 g kg-1。

2 134 荧光检测器[15]:在样品前处理过程中加入硼氢化钾,将孔雀石绿还原成无色孔雀石绿,荧光检测器定量检测。

该方法利用了无色孔雀石绿的荧光特性和荧光检测器的高灵敏度和选择性,有效地提高了检测的灵敏度,使检测限达到05 g kg-1。

但该方法对样品前处理要求较高,在处理过程中要保证所有的孔雀石绿都转化成无色孔雀石绿,操作上有一定的难度。

选用配备紫外可见检测器的高压液相色谱,对孔雀石绿和无色孔雀石绿的检测限都是2 g kg-1,不能满足欧盟法规对孔雀石绿和无色孔雀石绿总量2 g kg-1的限制规定。

只有采用荧光42第1期刘海新等:水产品中孔雀石绿检测方法研究进展检测器才能将其灵敏度提高到0 5 g kg-1,符合各国食品进出口检验的要求。

2 1 4 液相色谱质谱联用检测法选用配备紫外可见和荧光检测器的高压液相色谱法,其优势在于对目标物定量分析,并不能对检测结果给出可靠的定性结果,存在假阳性风险。

因此,在水产品进出口检验中还要求对所检出的阳性样品有定性的确证结果。

目前,有机小分子的定性分析,主要以质谱的定性分析结果为主。

根据欧盟法案2002/657/EC[4]要求,在农药和兽药残留分析中,对禁用药(G roupA),以质谱作为确证方法,必须达到4个点的要求。

低分辨率单级质谱要监测4个离子,一个用于定量,三个用于确证;高分辨率单级质谱要监测2个离子,一个用于定量,一个用于确证;多级质谱要监测1个母离子和2个产物离子,产物离子一个用于定量,一个用于确证。

以液相色谱质谱联用检测孔雀石绿,目标化合物分离与高压液相色谱法原理相同,都是应用反相色谱柱分离,运用质谱检测的目的是通过质谱的高选择性,进一步提高检测结果定性、定量的准确性和灵敏度;另外,以质谱为检测器,可以用氘代孔雀石绿和氘代无色孔雀石绿为内标,应用内标法检测,降低由于前处理过程中目标化合物的损失所带来的定量结果的偏差,提高定量的准确性。

2 1 4 1 单四极杆质谱[14]:以单四极杆为检测器的液质联用仪,虽然选择离子监控(SI M)模式,可提高灵敏度和定性的准确性,但液相色谱柱分离能力低,且四极杆为低分辨率质谱(质量分辨率只能达到0 5Da),检测结果背景干扰大。

在低浓度水平的复杂基质中,阳性结果较难确证。

2 1 4 2 离子阱质谱[16]:离子阱质谱也属于低分辨率质谱,虽然它可以通过多级质谱来提高其定性的准确性,但仪器本身固有的质量歧视效应(1/3质量效应)、空间电荷效应、定量线性范围窄、质量准确度差等缺陷,其定性和定量的准确性都不高。

因此采用离子阱质谱检测主要在科研上,质检部门大多不采用该仪器检测。

2 1 43 串联四极杆质谱[13,17]:该方法是目前国家标准[13]的检测方法,也是各国进出口检验部门普遍采用的检测方法。

应用三重极极杆多重反应监测(M u ltiple Reacti o n M on itor,MRM)定量分析的功能:第一级四级杆挑选出监测离子,第二级四极杆进行碰撞反应,第三级四极杆挑选出一个离子用于定量,一个离子用于确证。

该仪器通过第一级四极杆的离子选择,有效地降低了背景的干扰,极大提高了灵敏度和定性准确性。

2 1 4 4飞行时间质谱[3]:飞行时间质谱属高分辨率质谱,其质量分辨率可达到1mDa,高质量选择性有效地降低了背景干扰,定性和定量准确性高。

在样品分析中,选择2个监测离子,一个离子用于定量,一个离子用于确证。

飞行时间质谱与串联四极杆质谱比较,其灵敏度稍低,但还是能满足各国相关法规对孔雀石绿检测的要求。

总体来说,采用液相色谱质谱联用测定水产品中孔雀石绿残留量,其灵敏度都能达到0 5 g kg-1的水平,符合相关法规的要求。

但在低浓度水平的复杂基质中,定性结果的可靠性差异较大,单四极杆和离子阱质谱测定结果较难确证;串联四极杆和飞行时间质谱的检测结果较可靠。

2 1 5 气相色谱质谱联用[18]孔雀石绿沸点高、不易挥发,但无色孔雀石绿是易挥发的有机物,可以用气相色谱质谱联用检测无色孔雀石绿。

无色孔雀石绿在水生动物体内的代谢速度慢、残留期长,在阳性样品中,主要还是以无色孔雀石绿残留为主。

因此,采用气相色谱质谱联用对水产品中无色孔雀石绿残留进行定性检测也是有一定的实际意义。

气相色谱单四极杆质谱联用检测无色孔雀石绿,选用12 5 -M H P-1毛细管柱分离,质谱检测器以选择离子监控(SI M)模式监测四个离子,进行定性、定量分析,气相色谱毛细管柱分离度高,检测结果背景干扰小,检测灵敏度和定性准确性都较理想。

2 2 免疫学检测法酶联免疫法(enzy m e-li n k i m m unosorbent assay,ELISA)[19]:ELISA方法的基本原理是将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合,结合产物不会改变抗体的免疫学特性,也不影响酶的生物学活性。